流感病毒NS1蛋白以及SARS冠狀病毒N蛋白參與的免疫逃逸機(jī)制研究.pdf

1、A型流感病毒(influenza virus A)屬于正粘病毒科，流感病毒屬；基因組由大小不同的8個(gè)獨(dú)立的單股負(fù)鏈RNA片段組成，其中非結(jié)構(gòu)蛋白1(nonstructural proteinl,NSl)由NS基因編碼，NS1蛋白主要有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，N-末端的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RNAbinding domain，RBD）參與RNA結(jié)合；C-末端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(Effect domain,ED)，能夠同宿主細(xì)胞內(nèi)多種重要蛋白發(fā)生相互作用，是重要

2、的功能結(jié)構(gòu)域。NS1是一種多功能蛋白質(zhì)，其實(shí)現(xiàn)病毒逃逸天然免疫功能主要通過(guò)與宿主蛋白相互作用，抑制宿主相應(yīng)的通路或抗病毒蛋白功能；NS1能同病毒復(fù)制中間體 RNA結(jié)合，阻斷宿主識(shí)別病原相關(guān)分子模式；NS1還具有抑制抗宿主蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等諸多功能。病毒與宿主相互作用，共同決定了病毒感染的進(jìn)程以及宿主的命運(yùn)。
　　2009年流感病毒是一株重組病毒，由于其發(fā)生抗原漂移使人類(lèi)缺乏免疫力，從而導(dǎo)致病毒大范圍傳播。2009年大流行

3、流感病毒在傳染規(guī)律以及致病性和季節(jié)性流感以及以往的高致病性甲型流感存在差異，具體表現(xiàn)為感染重癥人群主要為青壯年，人群整體致死率較低等特點(diǎn)。
　　本研究通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析以及序列對(duì)比分析，我們發(fā)現(xiàn)2009年NS1與傳統(tǒng)NS1分群在進(jìn)化上具有明顯差別，進(jìn)一步分析NS1氨基酸位點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)2009年大流行NS1蛋白在第6、78、98、119、129以及171六個(gè)氨基酸位點(diǎn)具有序列保守性，與其他 NS1相比則表現(xiàn)為罕見(jiàn)突變。通過(guò)多位點(diǎn)聯(lián)合突

4、變以及單位點(diǎn)突變，我們進(jìn)一步分析研究最終確定其第171位點(diǎn)可能發(fā)揮相當(dāng)重要功能。在2009年流行的流感病毒中，171位點(diǎn)為Y（酪氨酸），十分保守，而在所有流感病毒中，171位點(diǎn)氨基酸主要為D（天冬氨酸）。熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)流感病毒NS1蛋白171位點(diǎn)為酪氨酸Y時(shí)，NS1的表達(dá)能夠增強(qiáng)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，而當(dāng)此位點(diǎn)由酪氨酸Y突變?yōu)樘於彼酓之后這種增強(qiáng)功能喪失。相應(yīng)的使用PR8病毒NS1171位點(diǎn)突變?yōu)閅同樣有此現(xiàn)象。有可能一

5、方面NS1171位點(diǎn)Y突變不能有效阻止細(xì)胞mRNA的加工成熟過(guò)程，另一方面，我們檢測(cè)到2009年大流行流感病毒NS1蛋白的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞整體泛素化，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)RIG-I泛素化，并且是K63位泛素化激活，而當(dāng)171位點(diǎn)氨基酸由Y突變?yōu)镈時(shí)這種激活能力喪失。我們拯救了2009年大流行野生型流感病毒株以及171位點(diǎn)突變病毒株，通過(guò)病毒實(shí)驗(yàn)研究NS1蛋白位點(diǎn)改變后的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果表明，171位點(diǎn)為D的流感病毒感染能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞

6、表現(xiàn)出更高水平的凋亡。提示171位點(diǎn)Y可能與2009年流感病毒表現(xiàn)出較低的致病性相關(guān)。
　　另外一部分工作是關(guān)于SARS冠狀病毒N蛋白拮抗干擾素機(jī)制研究。
　　SARS冠狀病毒(SARS-CoV)是嚴(yán)重急性呼吸道綜合征的病原體，其傳播速度快、致病性強(qiáng)、致死率高，其臨床變現(xiàn)為表現(xiàn)為非典型性肺炎。其主要結(jié)構(gòu)蛋白核殼體蛋白(N蛋白)通過(guò)抑制 I型干擾素的產(chǎn)生，在病毒感染中扮演重要角色。實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，N蛋白與視黃酸誘導(dǎo)基因

7、RIG-I（retinoic acid-inducible gene I）的E3泛素連接酶TRIM25相互作用。本研究對(duì)前期的結(jié)果進(jìn)行完善補(bǔ)充，進(jìn)一步確定N蛋白的干擾素抑制能力，并且發(fā)現(xiàn)N蛋白不僅抑制干擾素產(chǎn)生，同樣抑制干擾素下游轉(zhuǎn)錄因子的激活，發(fā)揮更多的功能。
　　SARS冠狀病毒和2009年大流行流感病毒是人類(lèi)進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)遇到的世界范圍內(nèi)病毒感染事件。2002年SARS的爆發(fā)使人類(lèi)更加認(rèn)識(shí)到冠狀病毒的危害，為建立相應(yīng)衛(wèi)生防

8、御預(yù)防體制奠定了基礎(chǔ)；2009年爆發(fā)的甲型H1N1流感病毒世界范圍內(nèi)大流行更加深了人類(lèi)對(duì)流感病毒的恐慌。
　　病毒參與的免疫逃逸研究能夠使我們對(duì)病毒的致病機(jī)制進(jìn)行更好地了解，有針對(duì)性的預(yù)測(cè)、預(yù)防、治療由病毒流行感染引起的大范圍人群感染。進(jìn)一步，可以針對(duì)性的開(kāi)發(fā)疫苗，為開(kāi)發(fā)藥物提供靶點(diǎn)。
　　本研究鑒定了NS1新的與致病性相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)，研究了位點(diǎn)功能。進(jìn)一步完善SARS冠狀病毒抑制干擾素相關(guān)研究，最終可能有助于我們了解病毒