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1、NS1(non-structuralprotein1)是一種與流感病毒毒力密切相關(guān)的多功能蛋白質(zhì),它通過(guò)與宿主細(xì)胞多種組分相互作用,發(fā)揮復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。不同毒株NS1蛋白的氨基酸序列存在差異,這造成不同毒株NS1蛋白引起的細(xì)胞凋亡效應(yīng)以及其在細(xì)胞中的定位也不盡相同,從而對(duì)流感病毒的致病力產(chǎn)生一定的影響,但確切的分子機(jī)制并不清楚。本研究以人季節(jié)性流感病毒H3N2亞型和新型禽流感病毒H7N9亞型的NS1蛋白為研究對(duì)象,分別解析了H3N2/
2、NS1蛋白和H7N9/NS1蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,同時(shí)揭示不同毒株NS1蛋白在細(xì)胞中的定位情況。
在本研究中,我們首先克隆不同毒株NS1蛋白的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,對(duì)表達(dá)NS1蛋白的細(xì)胞中caspase3/7的活性和PARP(poly ADP-ribose polymerase)的剪切進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,H3N2/NS1能夠誘導(dǎo)激活caspase3/7,并剪切PARP。生物信息學(xué)分析H3N2/NS1蛋白C末端
3、含有一個(gè)核仁定位信號(hào)(nucleolar localization signal,NoLS)。免疫熒光與免疫沉淀結(jié)果表明 H3N2/NS1能靶向細(xì)胞核仁并與核仁素(nucleolin,NCL)相互作用。熒光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot檢測(cè)H3N2/NS1蛋白表達(dá)的細(xì)胞中pre-45S rRNA的合成以及p53蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示與mock相比,H3N2/NS1蛋白表達(dá)的細(xì)胞中rRNA的合成減少至
4、20~30%,p53蛋白顯著積累。進(jìn)一步的染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)果顯示H3N2/NS1表達(dá)的細(xì)胞中,NCL與rRNA啟動(dòng)子區(qū)上游控制元件(upstream control element,UCE)的結(jié)合顯著減少,同時(shí)RNA聚合酶I大亞單位RPA194與UCE的相互作用也明顯受到影響。對(duì)基因組DNA亞硫酸鹽處理后的甲基化特異PCR結(jié)果顯示,與mock細(xì)胞相比,H3N2/NS1表達(dá)的細(xì)胞UCE高甲基化(95.5% vs25.7%)。對(duì)NCL進(jìn)行s
5、iRNA干擾,結(jié)果顯示在NCL合成受到抑制的情況下,pre-45S rRNA的合成顯著下降、p53蛋白明顯積累、UCE甲基化程度顯著上調(diào),并且對(duì)NCL的干擾效果越好,細(xì)胞中pre-45S rRNA下降、p53蛋白增加以及UCE甲基化程度越明顯。免疫共沉淀的結(jié)果顯示,核糖體蛋白R(shí)PL5、RPL11、RPL23以及RLPS7均能夠與MDM2相互作用。通過(guò)這一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們提出H3N2/NS1蛋白誘導(dǎo)HEK293T細(xì)胞凋亡的新機(jī)制:NS
6、1蛋白C末端的NoLS使NS1蛋白靶向細(xì)胞核仁并與NCL結(jié)合,二者的結(jié)合使得rRNA啟動(dòng)子UCE高甲基化,進(jìn)而使UCE與NCL的結(jié)合受阻,同時(shí)影響RNA聚合酶I與UCE的結(jié)合,進(jìn)而使RNA聚合酶I介導(dǎo)的rRNA轉(zhuǎn)錄受到抑制,引發(fā)細(xì)胞的核仁應(yīng)激,rRNA與核糖體蛋白(Ribosomal proteins,RPs)裝配受到干擾,游離的RPs從核仁中釋放出去并綁定MDM2,從而抑制p53的泛素化降解,引起細(xì)胞中p53的積累,從而激活caspa
7、se3/7,剪切PARP引起細(xì)胞凋亡。
另外,我們轉(zhuǎn)染H7N9/NS1表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)A549細(xì)胞,通過(guò)檢測(cè)caspase3/7活性以及PARP的剪切,明確H7N9/NS1能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,qPCR以及Western blot檢測(cè)Bad和BAK的表達(dá)以及Cleaved-Caspase-7,結(jié)果顯示H7N9/NS1表達(dá)的細(xì)胞中BAK1和Bad的水平顯著增加,caspase-7表達(dá)上調(diào)。qPCR和Western blot檢測(cè)H7
8、N9/NS1轉(zhuǎn)染不同時(shí)間p53的mRNA和蛋白的表達(dá)變化,結(jié)果顯示H7N9/NS1轉(zhuǎn)染18和24 h后,細(xì)胞中p53的表達(dá)量分別提高1.5~1.8倍,而mRNA的水平并無(wú)顯著變化。我們對(duì)p53的ser15、ser20、ser37以及ser46位的磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明p53在ser37和ser46的磷酸化水平升高,分別為2.89倍和3.05倍,而在ser15和ser20沒(méi)有發(fā)生明顯的磷酸化。這些結(jié)果顯示,H7N9/NS1的表達(dá)能夠
9、使p53發(fā)生ser37和ser46位點(diǎn)的磷酸化,進(jìn)而增加p53的穩(wěn)定性,激活caspase3和caspase7并剪切PARP,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
此外,我們構(gòu)建了H1N1/NS1,H3N2/NS1,H5N1/NS1,H7N9/NS1的GFP融合表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和細(xì)胞質(zhì)核分離實(shí)驗(yàn),研究不同毒株NS1蛋白在8株不同細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示,4種不同毒株NS1在所有8株細(xì)胞核中的分布都占主導(dǎo)地位,除此之外的分布又各有特點(diǎn):
10、H1N1/NS1與H7N9/NS1都呈現(xiàn)典型的細(xì)胞質(zhì)分布;H3N2/NS1和H5N1/NS1在細(xì)胞質(zhì)中的定位不明顯;H3N2/NS1在核質(zhì)均勻分布并在核仁處聚積,而H5N1/NS1僅分布在細(xì)胞核質(zhì)中。同時(shí)各NS1蛋白在Vero細(xì)胞質(zhì)中分布均不明顯,而在COS-7細(xì)胞中所有4種NS1蛋白均呈現(xiàn)一致的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分布,在細(xì)胞核仁中均不可見,包括H3N2/NS1蛋白。NS1蛋白亞細(xì)胞定位具有毒株和細(xì)胞特異性。
綜上,本研究分別解析
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