H5N1 NS1 eIF4GI結(jié)合區(qū)缺失毒感染CEF蛋白質(zhì)組學及HNRNPK促流感病毒增殖的機制研究.pdf

1、禽流感病毒宿主范圍廣泛，不僅可以感染各種禽類，對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失，偶爾也可感染人類，因其感染后引起的高死亡率而嚴重危害著人類的生命健康。流感病毒的生存嚴格依賴于宿主細胞，病毒的感染、復制、致病以及逃避宿主免疫離不開與宿主各種蛋白發(fā)生相互作用。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是流感病毒的一個重要的毒力因子，它能夠通過多種策略逃避宿主免疫反應(yīng)而調(diào)節(jié)病毒的復制。NS1蛋白的81-113位氨基酸能夠招募宿主蛋白真核翻譯起始因子4GI(eIF4GI)

2、到病毒mRNA5'端未翻譯區(qū)，優(yōu)先翻譯病毒mRNA，促進病毒復制。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)NS1片段缺失eIF4GI結(jié)合區(qū)的重組H5N1禽流感病毒(rNS1-SD30)相對于野生病毒(rNS1-wt)，在體內(nèi)和體外實驗中其毒力和致病性都顯著地降低，并且在MDCK細胞上抑制干擾素的能力也受到損傷。然而重組缺失毒rNS1-SD30感染引起的宿主蛋白變化，以及有那些宿主因子參與了毒力及其致病的降低的作用機制還不清楚。
　　不均一核糖核蛋白（

3、HNRNPs）家族蛋白的功能繁多，主要參與細胞中mRNA的剪接、轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定、翻譯和轉(zhuǎn)運等的調(diào)節(jié)功能，一些蛋白還參與了宿主的免疫調(diào)節(jié)。近年來有關(guān)HNRNPs調(diào)控病毒復制的研究越來越多，通過調(diào)節(jié)病毒mRNA的剪接以及與病毒蛋白互作調(diào)節(jié)病毒復制，而HNRNPK參與了多個病毒的復制過程。HNRNPK直接與甲型流感病毒的M1mRNA結(jié)合促進M1mRNA剪接產(chǎn)生M2mRNA，導致編碼產(chǎn)生的M2蛋白增多，進而促進流感病毒的復制。然而HNRNPK與流感

4、病毒蛋白的相互作用以及是否參與了宿主的天然免疫調(diào)節(jié)還不清楚。
　　本研究采用比較蛋白質(zhì)組學的方法研究了rNS1-wt及rNS1-SD30病毒感染雞胚成纖維(CEF)細胞后蛋白質(zhì)的差異表達情況，研究了差異表達蛋白ANXA7對病毒增值以及禽天然免疫調(diào)節(jié)的作用，還研究了人源HNRNPK與流感病毒的相互作用以及調(diào)控IFN產(chǎn)生的作用機制。本研究主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.rNS1-wt及rNS1-SD30病毒感染CEF的蛋白質(zhì)組

5、學研究
　　rNS1-wt及rNS1-SD30病毒感染CEF12h，24h和36h后運用蛋白質(zhì)組學鑒定到81個差異表達宿主蛋白，對鑒定到的蛋白進行功能分類分析，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要參與了細胞骨架的形成、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、mRNA加工剪切、運輸和代謝以及信號轉(zhuǎn)導等進程。進而克隆表達部分基因并研究其對病毒復制的影響，發(fā)現(xiàn)ANXA7抑制rNS1-SD30在DF1細胞的增殖，而對rNS1-wt并沒有影響。
　　2.ANXA7

6、通過調(diào)節(jié)MDA5的表達正調(diào)控雞RLR信號通路
　　構(gòu)建了雞RLR信號通路研究平臺，發(fā)現(xiàn)ANXA7、ALDH7A1及DCTN2等蛋白促進MDA5誘導的IFN-β產(chǎn)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)ANXA7促進rNS1-SD30刺激的IFN-β產(chǎn)生，而并不影響rNS1-wt誘導的IFN-β產(chǎn)生。ANXA7促進polyI∶C及MDA5介導的IFN-β產(chǎn)生通過靶向MDA5并調(diào)節(jié)其蛋白表達，同時ANXA7與MDA5存在相互作用，其C端鈣離子磷脂結(jié)合區(qū)是促

7、進IFN-β的關(guān)鍵區(qū)域。
　　3.人源HNRNPK通過與NS1蛋白互作促進流感病毒增殖
　　流感病毒感染A549細胞下調(diào)HNRNPK的表達，同時過表達HNRNPK顯著促進多個亞型流感病毒的增殖，沉默HNRNPK抑制病毒的增殖。進一步發(fā)現(xiàn)HNRNPK與NS1存在RNA非依賴性的相互作用，NS1的N端RBD以及HNRNPK的RNA結(jié)合區(qū)KH2和蛋白-蛋白互作區(qū)KI是NS1與HNRNPK發(fā)生相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。HNRNPK的RNA

8、結(jié)合區(qū)KH2和核穿梭區(qū)KNS是促進流感病毒增殖的關(guān)鍵區(qū)域。
　　4.HNRNPK抑制IFN-β產(chǎn)生并參與到NS1逃避的天然免疫
　　研究發(fā)現(xiàn)HNRNPK抑制流感病毒和仙臺病毒(Sev)介導的IFN-β產(chǎn)生以及IRF3的磷酸化。進一步研究發(fā)現(xiàn)HNRNPK與RIG-Ⅰ信號通路的TRAF3發(fā)生相互作用，HNRNPK的兩個RNA結(jié)合區(qū)KH1和KH2以及蛋白互作區(qū)KI和TRAF3的RING finger在TRAF3與HNRNPK的相互