甲型流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和人CPSF30結(jié)合的抑制劑篩選.pdf

1、根據(jù)構(gòu)建的酵母雙雜交模型來篩選雙黃連口服液中能抑制甲型流感非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和人切割與多聚腺苷酸化特異性因子CPSF30結(jié)合的抑制成分。首先將雙黃連口服液原藥設(shè)置幾個濃度(v/v)，分別為0.15、0.2、0.25、0.3、0.35，將其加入平板中后接上酵母雙雜交模型菌，結(jié)果得出雙黃連口服液對模型菌的抑制濃度為0.3。采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇將雙黃連口服液分成四段-石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，根據(jù)雙黃連原藥的抑制濃度對其進行

2、活性篩選，最終發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯相有活性，表明乙酸乙酯相中有抑制NS1與CPSF30結(jié)合的活性物質(zhì)。通過硅膠層析法將乙酸乙酯相分離，共得到20個組分?；钚院Y選后確定二氯甲烷與甲醇比為98:2時洗脫的組分有活性。
　　 本實驗通過構(gòu)建4個中間載體來完成黃色熒光蛋白(yellow fluorescence protein，YFP)的兩個片段與NS1和CPSF30的融合。最終獲得包含兩個融合蛋白的兩個載體pGAL10CYCNS1-VN和pG

3、AL10CYCCPSF-VC，將其通過LiAc方法同時轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌W303B中，獲得重組釀酒酵母W303B[pGAL10CYCNS1-VN+pGAL10CYCCPSF-VC]。通過PCR擴增條帶進一步證實了模型的準確性。經(jīng)過制作玻片在熒光顯微鏡下對模型菌進行觀察，發(fā)現(xiàn)酵母菌在藍光激發(fā)下呈現(xiàn)黃綠色，證實了蛋白NS1和人CPSF30蛋白已經(jīng)發(fā)生了相互作用；用分別加有葡萄糖和半乳糖的YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)模型菌，在熒光顯微鏡下觀察模型菌，藍光激發(fā)

4、下加有半乳糖的YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)的模型菌呈現(xiàn)黃綠色熒光，而加有葡萄糖培養(yǎng)的模型菌無熒光出現(xiàn)，這說明熒光蛋白啟動子是受葡萄糖抑制的。這為篩選到抑制NS1和CPSF30結(jié)合的抑制劑奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　 此外，為了將來構(gòu)建雙色或多色熒光互補模型奠定理論基礎(chǔ)，論文對紅色熒光蛋白在酵母中的表達特性作了初步的研究。根據(jù)已發(fā)表基因序列設(shè)計引物，采用連續(xù)重疊PCR方法快速克隆獲得全長Dsred基因，將其與pMD-18T載體連接后進行測序鑒定。

5、通過In-fusion方法將鑒定正確的pMD-Dsred重組載體與釀酒酵母表達載體pYeDP60進行連接，測序后利用LiAc方法將鑒定正確的pYeDP60-Dsred重組表達載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌W303-1B中，PCR擴增篩選陽性克隆，獲得的W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后進行SDS-PAGE電泳分析和綠光激發(fā)熒光成像檢測。PCR擴增篩選和SDS-PAGE分析顯示，pYeDP60-Dsred重組表達載體已成功導(dǎo)

6、入釀酒酵母菌中，誘導(dǎo)表達產(chǎn)物相對分子質(zhì)量與預(yù)期相符，且誘導(dǎo)后工程菌可在綠光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。
　　 金絲桃素合酶能催化大黃素生成金絲桃素，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的金絲桃素合成酶基因序列，設(shè)計了6對引物，通過連續(xù)重疊PCR快速克隆得到了金絲桃素合成酶基因Hyp-1。構(gòu)建含Hyp-1基因的原核表達載體pET32ahyp，將該載體導(dǎo)入大腸桿菌進行誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE結(jié)果顯示樣品在36 kDa處有條帶，符合理論值的條帶表明，而對照在相應(yīng)位

7、置沒有條帶出現(xiàn)，這說明Hyp-1基因在大腸桿菌中獲得表達；通過Western blot檢測，結(jié)果表明，與對照相比，E.coli[pET32ahyp]經(jīng)免疫印跡后，在相應(yīng)的位置上出現(xiàn)了一條相應(yīng)的雜交帶。因此，確認重組的HYP-1蛋白具有特異的免疫活性，表明Hyp-1基因在E.coli中得到了表達。酶促反應(yīng)經(jīng)HPLC分析表明，Hyp-1確實能將大黃素催化形成金絲桃素，上述結(jié)果表明，我們克隆的Hyp-1基因確實是金絲桃素合酶基因，具備將大黃素