乙型腦炎病毒NS1蛋白的宿主互作蛋白篩選與鑒定.pdf

1、乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis viruses.JEV）是黃病毒科黃病毒屬的一員，其引起的乙型腦炎是一種蚊媒性的人畜共患病，具有明顯的季節(jié)性和傳染性。人感染JEV主要造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，豬感染主要引起母豬流產(chǎn)、公豬睪丸炎和仔豬腦炎等癥狀。NS1蛋白是JEV的一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒的復(fù)制、感染等過(guò)程。本研究以豬源JEV的NS1蛋白為誘餌蛋白，應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)從人腦組織cDNA文庫(kù)中篩選、鑒定

2、與其發(fā)生相互作用的宿主細(xì)胞互作蛋白，本研究將對(duì)闡明NS1蛋白在JEV的增殖復(fù)制機(jī)制中的作用奠定一定的基礎(chǔ)。
　　1、乙型腦炎病毒NS1蛋白誘餌酵母菌的構(gòu)建
　　提取豬源JEV SCYA201201株的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，PCR擴(kuò)增NS1基因，克隆至pGBKT7載體，經(jīng)PCR鑒定、雙酶切鑒定和序列測(cè)定，成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NS1，JEV NS1基因大小為1245bp;將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NS1轉(zhuǎn)化至酵

3、母菌Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建了JEV NS1蛋白誘餌酵母菌。
　　運(yùn)用Western blot技術(shù)從JEV NS1蛋白誘餌酵母菌的總蛋白樣品檢測(cè)到大小約46kDa的NS1蛋白，表明NS1基因能在誘餌酵母菌中表達(dá)。對(duì)該誘餌酵母菌進(jìn)行毒性效應(yīng)和自激活效應(yīng)檢測(cè):誘餌酵母菌與空載對(duì)照酵母菌在SD/-Trp平板上的長(zhǎng)勢(shì)和菌落數(shù)無(wú)明顯差異，表明NS1片段的插入對(duì)誘餌酵母菌無(wú)毒性作用;誘餌酵母菌與對(duì)照酵母菌在SD/-Trp/X-α-Gal

4、平板上長(zhǎng)出乳白色菌落且沒(méi)有變成藍(lán)色，在SD/-Trp/X-a-Gal/AbA平板上未見(jiàn)菌落，證明誘餌酵母菌無(wú)自激活效應(yīng)。本研究成功構(gòu)建了JEV NS1蛋白誘餌酵母菌，為進(jìn)一步篩選JEV NS1蛋白相互作用的宿主蛋白提供了研究材料。
　　2、乙型腦炎病毒NS1蛋白的宿主互作蛋白篩選
　　運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)將JEV NS1蛋白誘餌酵母菌與人腦組織cDNA文庫(kù)菌進(jìn)行雜交和兩輪篩選，第一輪以SD/-Trp/-Leu/X-a-Gal/

5、AbA營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基平板對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行篩選，獲得72個(gè)克隆子。第二輪篩選挑取藍(lán)色菌落克隆子，分別接種于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基平板，并反復(fù)進(jìn)行2次，共獲得7個(gè)陽(yáng)性克隆子。進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性克隆子利用Ampicillin抗性篩選、PCR鑒定和序列測(cè)定，獲得5個(gè)陽(yáng)性單克隆子;測(cè)定序列在Genbank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，5個(gè)陽(yáng)性克隆分別對(duì)應(yīng)α2-巨球蛋白(α2M)、人神經(jīng)元性分化因子6(N

6、euroD6)、DAZassociated protein2(DAZAP2)、金屬蛋白酶抑制劑4（TIMP-4）和鋅指蛋白251(ZNF251)。
　　對(duì)獲得的5個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行回復(fù)雜交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，分別將5個(gè)陽(yáng)性克隆子的文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建獵物酵母菌，將獵物酵母菌與誘餌酵母菌一對(duì)一組合進(jìn)行回復(fù)雜交驗(yàn)證，5個(gè)獵物酵母菌均為陽(yáng)性結(jié)果。本研究應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)從人腦組織cDNA文庫(kù)中成功篩選到了5種與JEV NS1蛋白

7、相互作用的宿主蛋白。
　　3、乙型腦炎病毒NS1蛋白與宿主互作蛋白相互作用的鑒定
　　構(gòu)建NS1蛋白和各宿主蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，提取豬源乙腦SCYA201201株的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模版，PCR擴(kuò)增NS1基因序列克隆至pEGFP載體，經(jīng)PCR鑒定、雙酶切和測(cè)序分析，成功構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-NS1，插入片段大小為1245bp;提取人胚腎細(xì)胞（293細(xì)胞）的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，根據(jù)Gene Ba

8、nk上5個(gè)宿主蛋白的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)合成引物并應(yīng)用PCR擴(kuò)增相應(yīng)的基因序列，克隆至pCMV-HA載體，經(jīng)PCR鑒定、雙酶切和測(cè)序分析，成功構(gòu)建各互作蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，插入片段大小分別為α2M741bp、NEUROD61012bp、DAZAP2504bp、 TIMP-4672bp、ZNF251825bp。
　　運(yùn)用Western blot檢測(cè)構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒在293細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示JEV NS1蛋白與3個(gè)宿主蛋白（α2M、D