人osteostat胞外段在大腸桿菌中的表達和生物活性分析.pdf

1、糖皮質(zhì)激素誘導的腫瘤壞死因子受體的配體(glucocorticoid-induced tumornecrosis factor receptor ligand，GITRL)是腫瘤壞死因子超家族(tumor necrosisfactor superfamily，TNFSF)中的第18個成員，主要在樹突狀細胞、B細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞及骨髓基質(zhì)細胞中表達，屬于Ⅱ型跨膜蛋白。新近的一項研究顯示，它抑制由RANK介導的外周血單個核細胞向破骨細

2、胞的分化，具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用，因此稱之為Osteostat。目前，對它調(diào)節(jié)破骨細胞分化的機制還知之甚少。
　　 Osteostat蛋白分為胞內(nèi)段、胞外段和跨膜區(qū)三個部分，胞外段含有C-類凝集素的基序?；诖?，我們采用基因工程的方法，在大腸桿菌中表達Osteostat胞外段重組蛋白，并應用報告基因技術(shù)檢測其生物活性。
　　 本文根據(jù)大腸桿菌對密碼子的偏嗜性和密碼子的簡并性原則，在不改變氨基酸序列的條件下，將Osteost

3、at的胞外段密碼子全部替換成大腸桿菌偏嗜的密碼子。利用重組PCR技術(shù)獲得大腸桿菌偏嗜性Osteostat的胞外段DNA序列。先將其克隆入pTA2中，經(jīng)測序正確后，再將其插入原核表達載體pQE-30Xa，獲得成功構(gòu)建的重組表達載體pQE/Osteostat。重組表達載體轉(zhuǎn)化E.coliM15[pREP4]進行誘導表達。在37℃、0.5 mM IPTG誘導表達4小時條件下，將誘導表達菌制備細胞抽提物，可溶部分和沉淀部分分別行SDS-PAGE

4、，觀察到細胞裂解物沉淀在預期分子量位置有明顯的蛋白表達條帶。免疫印記Western-blotting顯示預期位置蛋白可與抗His抗體發(fā)生免疫識別，證明此重組蛋白確系His-Osteostat重組融合蛋白。改變表達目的蛋白的溫度、時間和誘導劑的濃度，優(yōu)化目的蛋白表達的條件，獲得最適的表達條件：表達溫度37℃，加入誘導劑IPTG后表達時間6小時，誘導劑IPTG的使用濃度為0.5 mM。目的蛋白含6×His純化標簽，可以經(jīng)金屬螯合親和層析吸附

5、于Ni-NTA樹脂層析柱，沖洗除去非特異吸附的雜蛋白后，將目的蛋白洗脫，獲得目的蛋白的初級純品。通過透析的方法除去洗脫液中的咪唑、尿素和一些鹽離子。利用BCA法測得透析液總蛋白濃度，并將透析液行SDS-PAGE還原凝膠電泳，UVP凝膠分析系統(tǒng)分析純化后融合蛋白的純度。
　　 GITRL的受體為GITR(glucocorticoid-induced tumor necrosis factorreceptor)，也叫做糖皮質(zhì)激素誘導

6、的腫瘤壞死因子受體，是腫瘤壞死因子受體超家族成員。大量研究表明，GITRL/GITR具有許多生物學活性，包括細胞的增殖、分化和存活等。國外一項研究顯示：GITRL/GITR配受體結(jié)合可以激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路?；谶@樣的發(fā)現(xiàn)，我們通過報告基因技術(shù)檢測重組Osteostat胞外段蛋白的生物學活性。首先，構(gòu)建人GITR編碼基因的表達載體，建立穩(wěn)定表達GITR基因的HEK293細胞株。然后，用包含NF-κB增強子序列的報告基因載體(luc