大腸桿菌中的基因表達(dá)

1、第二章 基因工程制藥,第一節(jié) 概 述第二節(jié) 目的基因的獲得第三節(jié) 基因表達(dá)第四節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性第五節(jié) 基因工程菌中試第六節(jié) 重組工程菌的培養(yǎng)第七節(jié) 基因工程藥物的分離純化第八節(jié) 變性蛋白的復(fù)性第九節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制,,第二章 基因工程制藥,一、基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn) 二、基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程

2、三、國內(nèi)外基因工程藥物研究進(jìn)展,基因工程技術(shù)誕生：20世紀(jì)70年代 現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展 基因工程： 應(yīng)用DNA重組技術(shù)，按照人們的意愿，在基因水平上改變生物 遺傳性，創(chuàng)造新的生物物種，通過工程化手段為人類提供有用產(chǎn)品和服 務(wù)的技術(shù)。,1. 大量生產(chǎn)過去通過常規(guī)生化分離提取技術(shù)難以獲得（富集）的 生理活性蛋白和多肽。 2. 提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)。 3.

3、開發(fā)更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。 4. 通過基因工程和蛋白質(zhì)工程對(duì)天然生理活性物質(zhì)進(jìn)行改造，優(yōu) 化天然的生理活性物質(zhì)。 5. 利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源。 6. 降低成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量。,1. 目的基因的獲得 2. 構(gòu)建DNA重組體 上游技術(shù) 3. 構(gòu)建工程菌 4. 工程菌的發(fā)酵 5. 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化

4、6.產(chǎn)品的檢驗(yàn),,,目前研制的基因工程藥物主要包括: 1. 免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體; 2. 細(xì)胞因子，如各種干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激生長因子 表皮生長因子、凝血因子； 3. 激素，如胰島素、生長激素、心鈉素； 4. 酶類，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、組織型纖維蛋白溶酶激

5、 活劑、超氧化物歧化酶等。,Vitamin A,一、 反轉(zhuǎn)錄法 二、化學(xué)合成法,1．mRNA的純化 （1）選擇表達(dá)目的蛋白質(zhì)豐度高的 mRNA的生物材料。 （2）分離總RNA。 （3）分離mRNA（多聚T纖維素）,2．cDNA第一鏈的合成（RT-PCR，隨機(jī)引物）3．cDNA第二鏈的合成4．cDNA克隆

6、5．將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞,6．cDNA文庫的鑒定,7．目的cDNA克隆的分離和鑒定,優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性高、人工接頭、改進(jìn)、利用 局限性： 1．小分子量的蛋白或多肽 2．已知核苷酸順序或氨基酸順序 3．費(fèi)用較高,Vitamin B2,基因表達(dá)的成敗，直接影響藥品的質(zhì)量、成本?；虮磉_(dá)是外 源基因在生

7、物體轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程，是外源基因異源轉(zhuǎn)錄 翻譯利用宿主功能的過程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主細(xì)胞 進(jìn)攻，保護(hù)自身的過程。,1. 原核細(xì)胞（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等） 2. 真核細(xì)胞（酵母、絲狀真菌、動(dòng)物細(xì)胞等）,1．原核細(xì)胞（1）大腸桿菌 優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清晰，生長迅速。 缺點(diǎn)：①胞內(nèi)表達(dá)，提取困難。

8、 ②包含體形式，需復(fù)性。 ③表達(dá)后不存在修飾作用，應(yīng)用受限。 ④翻譯產(chǎn)物的N末端常多余一個(gè)甲硫氨酸殘基（AUG啟始密碼子 編碼）容易引起免疫反應(yīng)。 ⑤大腸桿菌產(chǎn)生內(nèi)毒素給純化帶來不便。 ⑥蛋白酶水解作用破壞產(chǎn)物。,1．

9、原核細(xì)胞（2）枯草芽孢桿菌 優(yōu)點(diǎn)：分泌能力強(qiáng)，產(chǎn)物可直接到培養(yǎng)液中。 缺點(diǎn)：蛋白酶水解活性更強(qiáng)。 （3）鏈霉菌 優(yōu)點(diǎn)：①不致病 ②分泌能力強(qiáng) ③具有糖基化能力 缺點(diǎn)：培養(yǎng)條件要求高、遺傳穩(wěn)定性差,

10、2．真核細(xì)胞（1）酵母：無毒、倍增時(shí)間短、分泌功能、糖基化作用、使之 成為理想的宿主。（2）絲狀真菌：肽剪切、糖基化。（3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞：產(chǎn)品保真性高，生產(chǎn)效率低。,1．載體 表達(dá)載體必須具備下列條件： ①載體能獨(dú)立復(fù)制 ②具有多克?。∕CS）位點(diǎn)和標(biāo)記基因 ③具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子 ④具有調(diào)節(jié)基因 ⑤

11、具有很強(qiáng)的終止子 ⑥具有產(chǎn)生帶有SD序列和AUG的mRNA的能力,基因工程藥物研究中常用的表達(dá)載體 （1）PBV220系統(tǒng) ① PL、PR串聯(lián)啟動(dòng)子，增強(qiáng)啟動(dòng)信號(hào)。 ② rrnB基因的終止信號(hào)。 ③ PL、PR與rrnB之間有MCS及SD序列。 ④ CITS857抑制子基因（溫控誘導(dǎo)） ⑤質(zhì)粒較?。?66kb），便于插入大的外源基因,PBG-2:

12、 由PBV220衍生,可以表達(dá)與IgG結(jié)合的融合蛋白，并且是有蛋白剪切位點(diǎn)，便于表達(dá)后純化及純化后剪切。,（2）PET系統(tǒng) ① IPTG誘導(dǎo)（異丙基-硫代-D-半乳糖苷） ②多克隆位點(diǎn)上有NdeI或NCOI單一切點(diǎn)，切開后粘性末端為 ATG，便于外源基因插入表達(dá)。 ③在外源基因的N末端可融合6個(gè)His，便于純化。,2．影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素（1）外源基因的拷貝數(shù)（2）啟

13、動(dòng)子的強(qiáng)弱（3）SD序列的有效性（4）SD與ATG的間距（5）密碼子的組成（偏愛性）（6）產(chǎn)物的穩(wěn)定性（7）產(chǎn)物對(duì)宿主的影響,3．表達(dá)形式（1）融合蛋白，增強(qiáng)穩(wěn)定性。（2）非融合表達(dá)。,1．載體 ①YEP類（酵母附加體質(zhì)粒） 由大腸桿菌質(zhì)粒，2μm質(zhì)粒和Trp或URA3組成， ARS來自2μm質(zhì)粒。 ②YRP（酵母復(fù)制型質(zhì)粒）

14、 ARS來自染色體DNA、TrP1、URA3雙標(biāo)及大腸桿菌質(zhì)粒。 ③YCP（酵母著絲粒型質(zhì)粒） 除具有YRP元件外，還具有著粒成份。,,④YIP（酵母整合型質(zhì)粒） 含有可與染色體進(jìn)行同源重組的序列 ⑤酵母表達(dá)型質(zhì)粒 ⑥分泌型表達(dá)質(zhì)粒 帶有控制蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)序列,2．影響目的基因在酵母中表達(dá)的因素 （1）外源基

15、因的拷貝數(shù) （2）TATA盒啟動(dòng)子成分 （3）分泌信號(hào)序列 （4）終止序列 （5）翻譯后修飾 （6）對(duì)宿主影響,基因工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。,1. 質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定性： 指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比列不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。 主要與兩個(gè)因素有關(guān)：

16、 （1）含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代的頻率，質(zhì)粒丟失率與 宿主菌、質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件有關(guān)。 （2）含質(zhì)粒菌與不含質(zhì)粒菌比生長速率的差異的大小。 2. 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性： 指DNA從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失

17、所致工程菌性能的改變。,1. 選擇合適的宿主菌 2. 選擇合適的載體 3. 選擇壓力 4. 分階段控制培養(yǎng) 5. 控制培養(yǎng)條件 6. 固定化,一、工程菌選擇二、反應(yīng)器（發(fā)酵罐）設(shè)計(jì)三、發(fā)酵培養(yǎng)基組成四、工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測(cè)控制,一、基因工程菌的培養(yǎng)方式二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備

18、,基因工程產(chǎn)品純化前的性質(zhì)： ①目的產(chǎn)物在體系中含量較低 ②體系中組份復(fù)雜（細(xì)胞、代謝物、殘留培養(yǎng)基及無機(jī)鹽等） ③目的產(chǎn)物穩(wěn)定性差：對(duì)pH、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、 剪切力、表面活性劑等十分敏感，容易失活、變性。,1. 含目的產(chǎn)物的初始物料的特點(diǎn) 利用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)物，其上游過程中的各種因素 均對(duì)分離純化技術(shù)和工藝有直接影響。這些因

19、素包括： （1）菌種類型、形式，各種生物學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)物和副產(chǎn)物種類、 產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)所處的位置，表達(dá)方式（胞內(nèi)、胞外、包含體）， 代謝物種類，產(chǎn)物類似物、毒素和能降解產(chǎn)物的酶類等； （2）原材料和培養(yǎng)基的來源及質(zhì)量是否穩(wěn)定； （3）生產(chǎn)工藝和條件。包括滅菌方法和條件，生產(chǎn)方式(連續(xù)、批 式、半連續(xù))，生產(chǎn)周期，生產(chǎn)能力，工藝控制條件及方式等；

20、 （4）初始物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性。包括產(chǎn)物濃度、主要雜質(zhì) 種類和濃度、鹽的種類和濃度、溶解度、pH、粘度、流體力學(xué)性 質(zhì)和熱力學(xué)性質(zhì)等。,2. 物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì) 物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì)包括相關(guān)性和非相關(guān)性雜質(zhì)的含量、化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量、電荷性質(zhì)及數(shù)量、生物學(xué)特性、穩(wěn)定性(對(duì)熱、pH、鹽、有機(jī)溶劑等)、溶解度、分配系數(shù)、揮發(fā)性及吸附性

21、能等。,3. 目的產(chǎn)物的特性 目的產(chǎn)物特性主要有產(chǎn)物的化學(xué)、物理和生物學(xué)特性。 包括化學(xué)組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性(對(duì)熱、冷凍、pH、鹽、有機(jī)溶劑和金屬離子等)、疏水性、擴(kuò)散性、擴(kuò)散系數(shù)、分配系數(shù)、吸附性能、生物活性、親和性、配基種類、表面活性等。,4. 產(chǎn)品質(zhì)量要求 產(chǎn)品質(zhì)量要求主要包括產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)，產(chǎn)品用途，對(duì)純度、生物活性、比活的要求。允許的雜質(zhì)種類和最大允許含量，特殊

22、雜質(zhì)的種類和最大允許量，以及對(duì)使用的影響，產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性等。,,基因工程藥物的分離純化一般包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品、成品加工等步驟。,,分離純化的技術(shù)特點(diǎn)： ①條件溫和 ②選擇性好 ③收率要高 ④純化過程快速,1. 細(xì)胞收集 2. 細(xì)胞破碎,,,物理破碎法：高壓勻漿法、高速珠磨法、

23、 超聲破碎法、高壓擠壓法,化學(xué)破碎法：滲透沖擊、增溶法、 脂溶法,生物破碎法：酶溶法（溶菌酶、甘露糖酶 、 殼多糖酶等）,超聲破碎法,分離細(xì)胞碎片常用的方法有：離心沉淀：高速離心、超速離心膜過濾：微濾、超濾和反滲透雙水相萃?。壕垡叶?葡聚糖

24、 聚乙二醇-無機(jī)鹽,分離純化主要依賴色譜分離方法。 色譜技術(shù)包括： 離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、 凝膠過濾色譜、高效液相色譜等。,1. 離子交換層析： 是以離子交換劑為固定相， 依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換 劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí) 的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離 的一種層析方法。 pH、兩性分子、

25、側(cè)鏈、,2. 疏水層析： 是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差異，對(duì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離的層析方法。 疏水層析最常用填料是多聚糖（如瓊脂糖）及硅膠。 利用氨基酸側(cè)鏈的疏水鍵。,3. 親和層析： 是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間非常特異的生物親和力進(jìn)行吸附，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。,4. 凝膠過濾層析： 又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析，

26、是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對(duì)溶液中各組分進(jìn)行分離的液相層析方法。 大分子先從色譜柱中流出,1. DNA的去除 （1）DNA在pH 4. 0以上呈陰離子，可用陰離子交換劑吸附除去， 但目的蛋白質(zhì)PI應(yīng)在6. 0以上。 （2）如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，則可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑 上，而不讓DNA吸附上去。 （3）利用親和層析吸附蛋白質(zhì)，而DNA

27、不被吸附，也可分離。 （4）疏水層析對(duì)分離也有效，在上柱時(shí)需要高鹽濃度，使DNA-蛋 白質(zhì)結(jié)合物離解，蛋白質(zhì)吸附在柱上，而DNA不被吸附。,2. 熱原質(zhì)的去除（1）整個(gè)生產(chǎn)過程在無菌條件下進(jìn)行，防止產(chǎn)生熱原質(zhì)。（2）所有層析介質(zhì)在使用前先除去熱原質(zhì)，在2~8℃下進(jìn) 行操作，洗脫液需先經(jīng)無菌處理，流出的蛋白質(zhì)溶液 也應(yīng)無菌處理，即通過0. 2μm微濾膜，并在2

28、~8℃下保存。,3. 病毒的去除 成品中必須檢查是否含有病毒。病毒主要來源于宿主細(xì)胞。經(jīng)過色譜分離， 一般能除去病毒，必要時(shí)可以用紫外線照射使病毒失活，或過濾將病毒除去。,根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇根據(jù)分離單元之間的銜接選擇根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇（1）要具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。（2）要盡可能減少組成工藝的步驟。（3）組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝與設(shè) 備也能相互適應(yīng)。（4

29、）在工藝過程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干 擾產(chǎn)品質(zhì)量。（5）工藝時(shí)間要盡可能短。（6）工藝和技術(shù)必須高效，收率高，易操作，對(duì)設(shè)備要求低，能耗低。（7）具有較高的安全性。,一、包含體形成的原因二、包含體的分離和溶解三、包含體蛋白復(fù)性方法,包含體形成的原因主要是高水平表達(dá)的結(jié)果。在高水平表達(dá)時(shí)，新生肽鏈的聚 集速率一旦超過蛋白正確折疊的速率就會(huì)導(dǎo)致包含體的形成。重組蛋白在大腸桿菌中

30、表達(dá)時(shí)，缺乏一些蛋白折疊過程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，也導(dǎo)致包含體的形成。,電鏡下包含體顆粒,包含體雖然由無活性的蛋白組成，但包含體形成對(duì)重組蛋白的生產(chǎn)提供了幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：包含體具有高密度，易于分離純化；重組蛋白以包含體的形式存在有效地抵御了大腸桿菌中的蛋白酶對(duì)目的蛋白的降解；用于生產(chǎn)處于天然構(gòu)象對(duì)宿主細(xì)胞有毒害的蛋白。,,1.包含體的分離（1）對(duì)培養(yǎng)收集的重組菌進(jìn)行破碎（高壓勻漿、超聲波破碎等），為了提

31、 高破碎率，可以加入一定量的溶菌酶。（2）離心除去破碎上清液，沉淀部分用含有低濃度的變性劑（如脲和鹽酸 胍）、去垢劑（如Triton X-100）、脫氧膽酸鈉等化合物的緩沖液進(jìn)行 洗滌，如果需要對(duì)包含體進(jìn)行純化，一般多采用蔗糖密度梯度離心法。,,2.包含體的溶解 包含體的溶解一般都用強(qiáng)的變性劑如脲、鹽酸胍或硫氰酸鹽，或去垢劑如SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等；對(duì)于

32、含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑如巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇及半胱氨酸。溫度一般選擇在30℃以促進(jìn)溶解。此外，由于金屬離子具有氧化催化作用，還常常需要加入金屬螯合劑如EDTA以除去金屬離子。,有效的、理想的折疊復(fù)性方法應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn)： ①活性蛋白質(zhì)的回收率高。②正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)分離。③折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。④折疊復(fù)性方法易于放大。⑤復(fù)性過程耗時(shí)較少。,一、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品

33、質(zhì)量保證的一般性要點(diǎn)二、生物材料的質(zhì)量控制三、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制四、純化過程的質(zhì)量控制五、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制,產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià) 根據(jù)各個(gè)具體品種的情況，提出各不相同的安全性評(píng)價(jià)要求，這類制品安全性臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)范圍須根據(jù)不同情況作不同規(guī)定。,2. 產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu) 基因工程產(chǎn)品或人的多肽和蛋白質(zhì)相同，或其氨基酸序列或翻 譯后修飾上存在差異，或是非人源性或外源多肽和蛋白質(zhì)，如病毒、細(xì)菌抗原。對(duì)上述后

34、兩類產(chǎn)品，視其特點(diǎn)作藥動(dòng)學(xué)、毒理學(xué)研究。對(duì) 基因修飾產(chǎn)品，要作一般毒性、長期毒性以及致突變、致癌變和致畸變等遺傳毒理研究。,3. 嚴(yán)格控制條件 宿主細(xì)胞中表達(dá)的天然基因，轉(zhuǎn)錄或翻譯后，或精制、工藝放大過 程中，都有可能發(fā)生變化，故從原料到制成品制備全過程的每一步都須嚴(yán)格控制條件與鑒定質(zhì)量，確保符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格、安全有效。,原材料的質(zhì)量控制是要確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而

35、穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性，所以原材料的質(zhì)量控制主要是對(duì)目的基因、表達(dá)載體以及宿主細(xì)胞的檢查。,1.目的基因 根據(jù)指控要求，需明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過；對(duì)于改造過的基因應(yīng)說明被修改的密碼子、被切除的肽段及拼接的方法；使用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的基因，應(yīng)說明擴(kuò)增的模板、引物及酶反應(yīng)條件等情況，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列等分析方法確證基因結(jié)構(gòu)的正確無誤。,2. 表達(dá)載體

36、應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組成部分(如復(fù)制子、啟動(dòng)子)的來源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)記物等。,3.宿主細(xì)胞 應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性等；需闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，是否整合到染色體內(nèi)及拷貝數(shù)，并證明宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中，啟

37、動(dòng)與控制克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平。,在貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過積中，要求質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。,1.生產(chǎn)用細(xì)胞庫 需證明種子批不含致癌因子，無細(xì)菌、病毒、霉菌和支原體等污染，由原始種子批建生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫。 在同一實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)內(nèi)，不得同時(shí)操作兩種不同的細(xì)胞或菌種，一個(gè)工作人員也不得同時(shí)操作兩種不同的細(xì)胞或菌種。

38、 建原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用期，保存與復(fù)蘇時(shí)宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。 對(duì)生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長與產(chǎn)品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)穩(wěn)定性確定最高允許傳種代數(shù)。,2.培養(yǎng)過程 培養(yǎng)過程中，應(yīng)測(cè)定被表達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；

39、 依宿主細(xì)胞/載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間，并定期評(píng)價(jià)細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。 培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)的特性。,分離純化過程中，常用分級(jí)沉淀、超濾、電泳和色譜等技術(shù)，其質(zhì)量控制要求能保證去除微量DNA、糖類、殘余宿主蛋白質(zhì)、純化過程帶入的有害化學(xué)物質(zhì)及熱原質(zhì)，或者將這類雜質(zhì)都控制在規(guī)定限度以下。,純化工藝的每一步完成后均應(yīng)測(cè)定收獲物純度，計(jì)算提純倍數(shù)、收獲率等，要對(duì)每一步的純化效率、活

40、性回收率和蛋白回收率進(jìn)行檢測(cè)。 要明確使用的純化方法的原理、目的以及預(yù)期的去除雜質(zhì)的效果，在不同純化步驟中能去除不同性質(zhì)的雜質(zhì)，并進(jìn)行相應(yīng)的工藝驗(yàn)證。 純化方法的設(shè)計(jì)應(yīng)考慮到盡量去除污染病毒、核酸、宿主細(xì)胞雜蛋白、糖以及純化過程帶入的其他有害物質(zhì)。 純化工藝過程中應(yīng)盡量不加入對(duì)人體有害的物質(zhì)。,如用柱層析技術(shù)應(yīng)提供所用填料的質(zhì)量認(rèn)證證明，并證實(shí)從柱上不會(huì)掉下有害物質(zhì)。 上樣前應(yīng)清洗除去熱原質(zhì)

41、等。 若用親和層析技術(shù)，不應(yīng)含有可測(cè)出的異種免疫球蛋白。 如在反相純化步驟中用到乙腈或甲醇等有機(jī)溶劑，用Protein A親和層析純化抗體，有機(jī)溶劑和Protein A等這些對(duì)人體有害的物質(zhì)應(yīng)加以去除和控制。,基因工程藥物質(zhì)量控制主要包括以下幾項(xiàng)要求： 產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。 需要綜合利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生

42、物學(xué)等多門學(xué)科的理論與技術(shù)，保證基因工程藥品的安全有效。,1．生物活性測(cè)定多肽和蛋白質(zhì)藥物的生物學(xué)活性是蛋白質(zhì)藥物的重要質(zhì)量控制指標(biāo)。效價(jià)測(cè)定必須采用國際上通用的方法，測(cè)定結(jié)果必須用國際或國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正，以國際單位表示或折算成國際標(biāo)準(zhǔn)單位。生物學(xué)效價(jià)的測(cè)定往往需要進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)或通過細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行體外效價(jià)測(cè)定。體內(nèi)生物活性的測(cè)定要根據(jù)目的產(chǎn)物的生物學(xué)特性建立適合的生物學(xué)模型。體外生物活性測(cè)定的方法有細(xì)胞培

43、養(yǎng)計(jì)數(shù)法、3H-TdR摻入法和酶法細(xì)胞計(jì)數(shù)等。,蛋白質(zhì)的比活性是每毫克蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。它不僅是含量指標(biāo)，也是純度指標(biāo)。 由于蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)不能常規(guī)測(cè)定，而蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，特別是二硫鍵的錯(cuò)配，可影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，從而影響蛋白質(zhì)藥物的藥效，比活性可以間接地反應(yīng)這一情況。,2．理化性質(zhì)鑒別（1）非特異性鑒別 根據(jù)還原型電泳的遷移率和高效液相色譜的保留時(shí)間和峰型來 進(jìn)行分析。（2）特異性鑒

44、別 利用免疫印跡、免疫電泳、免疫擴(kuò)散等免疫學(xué)方法，確定蛋白 質(zhì)的抗原性。,（3）相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定最常用的方法有凝膠過濾法和SDS-PAGE法，凝膠過濾法測(cè)定完整的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量，而SDS-PAGE法測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量。（4）等電點(diǎn)測(cè)定 樣品用等點(diǎn)聚焦法測(cè)定等電點(diǎn)。在生產(chǎn)過程中，批與批之間的電泳結(jié)果應(yīng)該一致，以此控制生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。

45、,（5）肽圖分析 肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì)，對(duì)生成的肽段進(jìn) 行分離分析。是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中細(xì)微變化的最有效方法。 肽圖分析可作為制品與標(biāo)準(zhǔn)品作精密比較的手段，與氨基酸成分和序列分析結(jié)果合并，作為蛋白質(zhì)的精確鑒別。 該技術(shù)靈敏高效，是對(duì)基因工程藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證的首選方法。 同種產(chǎn)品不同批次的肽圖的一致性是工藝穩(wěn)定

46、性的驗(yàn)證指標(biāo)。,蛋白質(zhì)降解形成的肽段的鑒定可以用SDS-PAGE電泳法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）、毛細(xì)管電泳法及質(zhì)譜法來測(cè)定。,（6）氨基酸組成分析 一般對(duì)含50個(gè)左右的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的定量分析接近 理論值。 完整的氨基酸成分分析結(jié)果，應(yīng)包括甲硫氨酸、胱氨酸和 色氨酸的準(zhǔn)確值。 氨基酸成

47、分分析結(jié)果應(yīng)為三次分別水解樣品測(cè)定后的平均 值。測(cè)定的重組蛋白質(zhì)的氨基酸組成應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品一致。 氨基酸組成分析采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定，包括蛋白質(zhì) 水解、自動(dòng)進(jìn)樣，氨基酸分析、定量分析報(bào)告等內(nèi)容。,（7）部分氨基酸序列分析 此項(xiàng)是重組蛋白質(zhì)的重要鑒別指標(biāo)，一般要求對(duì)中試前 三 批產(chǎn)品至少應(yīng)該測(cè)定N端15個(gè)氨基酸，C端應(yīng)根據(jù)情況測(cè)定 1~3個(gè)氨基酸。（8）蛋白質(zhì)二硫鍵分析

48、 測(cè)定巰基的方法有別PMCB法、DTNB法、NEMI法等。,3.蛋白質(zhì)含量測(cè)定 主要用于原液比活性計(jì)算和成品規(guī)格的控制。 蛋白質(zhì)含量可根據(jù)其物化性質(zhì)采用Folin-酚試劑法、染色法（Bradford）、雙縮脲法、紫外吸收法，HPLC法和凱氏定氮法等方法，其中Folin-酚試劑法、染色法是在質(zhì)量檢定中常使用的方法。,4.蛋白質(zhì)純度分析 純度分析是基因工程藥物質(zhì)量控制

49、的關(guān)鍵項(xiàng)目。測(cè)定蛋白質(zhì)含量可根據(jù)其本身理化性質(zhì)和生物學(xué)特性設(shè)計(jì)。通常采用的方法有還原性及非還原性SDS-PAGE、等電點(diǎn)聚焦、各種HPLC及毛細(xì)管電泳等。,5.雜質(zhì)的檢測(cè) 基因工程產(chǎn)物的雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩類。,（1）蛋白類雜質(zhì) 在蛋白類雜質(zhì)中，最主要的是純化過程中殘余的宿主細(xì)胞蛋白。 測(cè)定采用免疫分析的方法。同時(shí)需輔以電泳等其他檢測(cè)手段補(bǔ)充和驗(yàn)證。 除宿主細(xì)胞蛋白

50、外，目的蛋白本身也可能發(fā)生某些變化，形成在理化性質(zhì)上與原蛋白質(zhì)極為相似的蛋白雜質(zhì)，在體內(nèi)往往會(huì)導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生，在質(zhì)量控制中也要加以嚴(yán)格控制。,（2）非蛋白類雜質(zhì) 具有生物學(xué)作用的非蛋白類雜質(zhì)主要有病毒和細(xì)菌等微生物、熱原質(zhì)、內(nèi)毒素、致敏原及DNA?；蚬こ趟幬飸?yīng)證實(shí)最終制品中無外源病毒和細(xì)菌等污染。 熱原質(zhì)可用傳統(tǒng)的注射家兔法進(jìn)行檢測(cè)。 目前鱟試驗(yàn)法測(cè)定內(nèi)毒素。

51、 必須用敏感的方法來測(cè)定來源于宿主細(xì)胞的殘余DNA的含量。,6.穩(wěn)定性考察 藥品的穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)藥品有效性和安全性的重要指標(biāo)之一，也是確定藥品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù)。 沒有一種單一的穩(wěn)定性試驗(yàn)或參數(shù)能夠完全反映基因工程藥物的穩(wěn)定性特征，必須對(duì)產(chǎn)品在一致性、純度、分子特征和生物效價(jià)等多方面的變化情況加以綜合評(píng)價(jià)。 采用恰當(dāng)?shù)奈锢砘瘜W(xué)、生物化學(xué)和免疫化學(xué)技術(shù)對(duì)其活性成分的性質(zhì)進(jìn)行

52、全面鑒定，并且要準(zhǔn)確檢測(cè)在貯藏過程中由于脫氨、氧化、磺?；?、聚合或降解等造成的分子變化，可選用電泳和高分辨率的HPLC，以及肽圖分析等方法。,由于蛋白質(zhì)是一種結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜的大分子物質(zhì)，可能同時(shí)存在多種降解途徑，其降解過程往往不符合Arrhenius動(dòng)力學(xué)方程，因此通過加速降解試驗(yàn)來預(yù)測(cè)基因工程藥物的有效期并不十分可靠。必須進(jìn)行在真實(shí)條件下、真實(shí)時(shí)間的長期穩(wěn)定性考察，才能確定其有效期限。,7．產(chǎn)品一致性的保證 以重組D

53、NA技術(shù)為主的生物制藥是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，生產(chǎn)周期可達(dá)一個(gè)月甚至更長，影響因素較多。 只有對(duì)從原料、生產(chǎn)到產(chǎn)品的每一步驟都進(jìn)行嚴(yán)格的控制和質(zhì)量檢定，才能確保各批最終產(chǎn)品都是安全有效、含量和雜質(zhì)限度一致并符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的。,目的產(chǎn)物失活受多種理化因素的影響，保存時(shí)要根據(jù)其不同特性，采用不同的措施，防止變性、降解，保護(hù)其活性。,1. 液態(tài)保存液態(tài)保存主要有4種常用方法： （1）低溫保存

54、 蛋白質(zhì)對(duì)熱敏感，溫度越高，穩(wěn)定性越差，在絕大多數(shù) 情況下可以低溫保存蛋白質(zhì)溶液，液態(tài)蛋白質(zhì)樣品在-20~- 10℃以下冰凍保存比較理想。（2）在穩(wěn)定pH條件下保存 多數(shù)蛋白質(zhì)只有在很窄的pH范圍內(nèi)才穩(wěn)定，超出此范圍 會(huì)迅速變性，蛋白質(zhì)較穩(wěn)定的pH一般在等電點(diǎn)，因而保存液 態(tài)蛋白質(zhì)樣品時(shí)，應(yīng)小心調(diào)到其穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)。,（3）高濃度保存 一般蛋白質(zhì)在高濃度溶液

55、中比較穩(wěn)定，保存時(shí)濃度不能 太 低，否則可能會(huì)引起亞基解離和表面變性。（4）加保護(hù)劑保存 可以降低蛋白質(zhì)溶液的極性，以免變性失活。這類蛋白 質(zhì)的穩(wěn)定劑有糖類、脂肪類、蛋白質(zhì)類、多元醇、有機(jī)溶劑 等；有些蛋白質(zhì)加入中性鹽可穩(wěn)定；某些蛋白質(zhì)可加入2-巰 基乙醇、二硫蘇糖醇等，在真空或惰性氣體中密閉保存。,2．固態(tài)保存 固態(tài)蛋白質(zhì)比液態(tài)穩(wěn)定。 長期保存蛋白質(zhì)