融合蛋白IFN-IgGFc在乳酸桿菌和大腸桿菌中的表達及其生物學活性研究.pdf

1、乳酸菌是食品工業(yè)生產中重要的菌種之一，也是人體主要益生菌之一，被公認為是安全的食品微生物(GRAS，Generally Recognized As Safe)。干擾素(Interferon，IFN)是病毒誘導細胞分泌的細胞因子，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)功能。用乳酸菌表達有藥用價值的生物學活性多肽，是當前國際上的研究熱點之一，對開發(fā)新的功能性食品具有廣闊的前景。 本論文應用PCR方法將人干擾素IFN-α-2b基因與IgG Fc

2、基因連接，并引入一段柔性連接肽，構建了融合蛋白基因IFN-IgG Fc，將融合蛋白基因克隆到原核表達載體中，分別轉化大腸桿菌和乳酸菌進行誘導表達、純化及鑒定，并研究了融合蛋白的生物學活性，本研究為基因工程乳酸菌及相關藥物的開發(fā)研究奠定了基礎。主要研究內容和結果如下： 1.將IFN-IgG Fc基因克隆到質粒pET30a中，構建了重組表達質粒pET30a/IFN-IgG Fc，轉化大腸桿菌BL21進行誘導表達，確定了誘導表達最大量

3、目的蛋白的最佳條件，蛋白表達量占菌體蛋白總重量的30％。對融合蛋白IFN-IgG Fc的純化工藝進行了研究，初步建立了離子交換純化工藝，純度可達90％以上。Western-Blot結果表明，純化后的干擾素融合蛋白對IFN-α-2b和IgG Fc兩種抗體都有免疫學反應，ELISA測定結果顯示兩段多肽能夠保持各自的構象。融合蛋白可誘導Wish細胞產生明顯的抗VSV病毒的作用，其比活性大于2.0×10<'5>IU/mg。 2.將融合蛋

4、白IFN-IgG Fc基因克隆到乳酸菌表達質粒pSC111 AE中，構建了重組表達質粒pSC111 AE/IFN-IgG Fc。用電轉化的方法將表達質粒轉化乳酸乳桿菌ATCC393，優(yōu)化了轉化條件。在乳桿菌中進行誘導表達，確定了最佳表達量時間。通過免疫學方法在表達上清液檢測出干擾素融合蛋白，ELISA測定表明兩段多肽能夠保持各自的構象。基因工程乳酸菌表達的上清液可以誘導Wish細胞產生明顯的抗VSV病毒的活性，其比活性為1.71×10<