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文檔簡介
1、乳酸菌是食品工業(yè)生產中重要的菌種之一,也是人體主要益生菌之一,被公認為是安全的食品微生物(GRAS,Generally Recognized As Safe)。干擾素(Interferon,IFN)是病毒誘導細胞分泌的細胞因子,具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)功能。用乳酸菌表達有藥用價值的生物學活性多肽,是當前國際上的研究熱點之一,對開發(fā)新的功能性食品具有廣闊的前景。 本論文應用PCR方法將人干擾素IFN-α-2b基因與IgG Fc
2、基因連接,并引入一段柔性連接肽,構建了融合蛋白基因IFN-IgG Fc,將融合蛋白基因克隆到原核表達載體中,分別轉化大腸桿菌和乳酸菌進行誘導表達、純化及鑒定,并研究了融合蛋白的生物學活性,本研究為基因工程乳酸菌及相關藥物的開發(fā)研究奠定了基礎。主要研究內容和結果如下: 1.將IFN-IgG Fc基因克隆到質粒pET30a中,構建了重組表達質粒pET30a/IFN-IgG Fc,轉化大腸桿菌BL21進行誘導表達,確定了誘導表達最大量
3、目的蛋白的最佳條件,蛋白表達量占菌體蛋白總重量的30%。對融合蛋白IFN-IgG Fc的純化工藝進行了研究,初步建立了離子交換純化工藝,純度可達90%以上。Western-Blot結果表明,純化后的干擾素融合蛋白對IFN-α-2b和IgG Fc兩種抗體都有免疫學反應,ELISA測定結果顯示兩段多肽能夠保持各自的構象。融合蛋白可誘導Wish細胞產生明顯的抗VSV病毒的作用,其比活性大于2.0×10<'5>IU/mg。 2.將融合蛋
4、白IFN-IgG Fc基因克隆到乳酸菌表達質粒pSC111 AE中,構建了重組表達質粒pSC111 AE/IFN-IgG Fc。用電轉化的方法將表達質粒轉化乳酸乳桿菌ATCC393,優(yōu)化了轉化條件。在乳桿菌中進行誘導表達,確定了最佳表達量時間。通過免疫學方法在表達上清液檢測出干擾素融合蛋白,ELISA測定表明兩段多肽能夠保持各自的構象。基因工程乳酸菌表達的上清液可以誘導Wish細胞產生明顯的抗VSV病毒的活性,其比活性為1.71×10<
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