人NKp46基因克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、一、目的:自然殺傷(NK)細(xì)胞來(lái)源于骨髓，主要存在于血液和淋巴樣組織，約占外周血淋巴細(xì)胞的5％-10％，通過(guò)NK細(xì)胞表達(dá)的特殊標(biāo)記很容易與其它型淋巴細(xì)胞區(qū)分。NK細(xì)胞屬于淋巴細(xì)胞譜系細(xì)胞群，是天然免疫反應(yīng)的重要效應(yīng)因子。NK細(xì)胞無(wú)需抗原刺激，就能殺傷腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞。NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用依賴于多個(gè)表面受體/配體的相互作用。 NK細(xì)胞表面存在許多受體。特別是有兩類顯著不同的受體，通過(guò)結(jié)合MHCⅠ類分子或未知配體，來(lái)負(fù)責(zé)調(diào)

2、節(jié)NK細(xì)胞的活性，它們是免疫球蛋白樣NK細(xì)胞受體(自然殺傷抑制性受體(KillerInhibitoryReceptors，KIR)、自然殺傷細(xì)胞毒受體(NaturalCytotoxicityReceptors，NCRs)、白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(leukocyteimmunoglobulinlikereceptor，LILR)、p75/AIRM1等)和C型凝集素樣NK細(xì)胞受體(CD94/NKG2，NKG2D，NKp80，NKRP1，等)

3、。這些受體顯著的特征是通過(guò)抑制或者激活而精確調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能。 抑制性受體信號(hào)是通過(guò)胞質(zhì)內(nèi)的免疫受體酪氨酸抑制基序(ImmunoreceptorTyrosine-basedInhibitoryMotifs，ITIM)介導(dǎo)的?；谑荏w/配體間相互作用，ITIM募集特異性磷酸酶(SHP-1，-2)，酪氨酸被磷酸化，這將導(dǎo)致胞內(nèi)激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)的抑制。許多抑制性受體(KIR，CD94/NKG2，Ly49和LILR)可識(shí)別MHCⅠ類分子，

4、這些受體以同源分布型被所有NK細(xì)胞所表達(dá)；它們與HLAⅠ類等位基因不同類別分子的相互作用使得正常細(xì)胞免于NK細(xì)胞溶解，這是由于此作用導(dǎo)致了自然細(xì)胞毒作用的抑制。NK淋巴細(xì)胞只殺傷那些轉(zhuǎn)化為腫瘤或病毒感染細(xì)胞，已知它們部分地或全部地喪失了MHCⅠ分子表達(dá)能力。這些觀點(diǎn)基于經(jīng)過(guò)小鼠和人類實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)的“missingself”假設(shè)。NK細(xì)胞不能溶解表達(dá)自身MHCⅠ分子的正常組織，而NK細(xì)胞的觸發(fā)通過(guò)非MHC限制性激活性受體介導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

5、 激活性受體通過(guò)藕聯(lián)在胞內(nèi)區(qū)包含免疫受體酪氨酸活化基序(ImmunoreceptorTyrosineActivatingMotifs，ITAM)的分子，如CD3ζ，F(xiàn)cεRIγ和DAP-12，來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。而ITAM是通過(guò)磷酸化之后p72syk和ZAP70胞質(zhì)PTK來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性信號(hào)的。NK細(xì)胞表達(dá)三種不同的能直接參與自然細(xì)胞毒作用的激活性受體，稱為自然細(xì)胞毒受體(NCRs)，它們是NKp46，NKp44和NKp30。 NCRs

6、屬于免疫球蛋白超家族(Ig-SF)，顯示有一個(gè)或兩個(gè)Ig-樣胞外區(qū)，在穿膜區(qū)通過(guò)含有ITAM分子轉(zhuǎn)導(dǎo)激活信號(hào)。特別說(shuō)明的是，每個(gè)NCRs的交聯(lián)都會(huì)導(dǎo)致三個(gè)結(jié)果：p56lck與p59fyn的激活、NCRs關(guān)聯(lián)多肽的酪氨酸磷酸化以及p72syk和ZAP70胞質(zhì)PTK的活化?！敖换プ饔谩惫δ艿拇嬖谝驳玫浇诎l(fā)現(xiàn)的支持，單個(gè)NCR的接合能夠激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其它NCR再由此導(dǎo)致NCR介導(dǎo)激活信號(hào)的放大。這些NK細(xì)胞所特有的表面受體，協(xié)同或增效參

7、與NK細(xì)胞激活作用溶解靶細(xì)胞。 NKp30基因位于人類染色體6q21.32，編碼一個(gè)30kD的糖蛋白，胞外區(qū)有1個(gè)IgV樣結(jié)構(gòu)域，在穿膜區(qū)與CD3ζ分子藕聯(lián)。NKp30在人類靜息及激活的NK細(xì)胞細(xì)胞表面均表達(dá)。NKp44基因位于人類染色體6q21.1，編碼蛋白胞外區(qū)帶有1個(gè)IgV樣結(jié)構(gòu)域，而在穿膜區(qū)含有一個(gè)賴氨酸，可能參與藕聯(lián)KARPAP/DAP12分子。NKp44在靜息的NK細(xì)胞上不表達(dá)，但能選擇性的表達(dá)在經(jīng)IL-2誘導(dǎo)的NK

8、細(xì)胞上。 NKp46是由Sivori等于1997年利用一種能激活NK細(xì)胞溶解作用的單克隆抗體識(shí)別出一種46kD的細(xì)胞表面分子，并命名為p46。這種分子缺乏N端連接糖，只表達(dá)在靜息和激活NK細(xì)胞上，而不表達(dá)在T細(xì)胞或B細(xì)胞上。除了細(xì)胞溶解作用外，這一單克隆抗體介導(dǎo)的關(guān)聯(lián)反應(yīng)還誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣離子的增加和生成細(xì)胞因子。通過(guò)篩查人NK細(xì)胞cDNA文庫(kù)，Pessino克隆出NKp46或叫LY94的cDNA，屬于免疫球蛋白超家族，能與其他激活性

9、受體(如LY95等)協(xié)同作用。 NKp46是參與NK細(xì)胞細(xì)胞毒作用最主要受體之一。NKp46的特征是胞外區(qū)有兩個(gè)Ig樣C2型結(jié)構(gòu)域，在穿膜區(qū)與酪氨酸磷酸化的CD3ζ和FcεRIγ交聯(lián)。NKp46的這兩個(gè)IgC2結(jié)構(gòu)域的全部結(jié)構(gòu)排列類似于白細(xì)胞免疫球蛋白受體-1(LIR-1，LIR-2或LILRB1)和KIR2D免疫受體。即使NKp46、LIR-1和KIR2D在結(jié)構(gòu)排列上相似，但是在LIR-1和KIR2D中負(fù)責(zé)HLA結(jié)合的氨基酸并

10、不保存在NKp46中。例如，KIR2DL2結(jié)合HLA-Cw3的區(qū)域位于D1D2中間鉸鏈區(qū)，而NKp46相應(yīng)區(qū)域并不存在這些氨基酸。這就提示推定的NKp46配體結(jié)合位點(diǎn)可能位于顯著不同于中間鉸鏈區(qū)的某個(gè)分子區(qū)。而且，這可能是NKp46,像其它NCR一樣，不結(jié)合經(jīng)典MHCI類分子實(shí)驗(yàn)證據(jù)的更進(jìn)一步的解釋。到目前為止，鑒定的NKp46配體只有流感病毒血凝素和副流感病毒血凝素-神經(jīng)氨基酶。但有關(guān)NKp46的特異性細(xì)胞配體尚未可知；要進(jìn)一步研究發(fā)

11、現(xiàn)人NKp46的相關(guān)配體，需要認(rèn)識(shí)NKp46細(xì)胞受體的結(jié)構(gòu)及其識(shí)別特異性，從分子水平了解NK細(xì)胞生物學(xué)功能。該研究采用基因工程的方法構(gòu)建了人NKp46表達(dá)載體，并獲得純化的重組蛋白，為尋找人NKp46相應(yīng)細(xì)胞配體做前期工作。 二、方法和結(jié)果 1.人NKp46基因克隆及序列分析 根據(jù)GeneBank報(bào)道人NKp46基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增成熟人NKp46基因的上、下游引物，分別在5'端加上限制性酶切位點(diǎn)Ncol和EcoR

12、I。設(shè)計(jì)上游引物時(shí)，在成熟人NKp46編碼序列上游加上起始密碼子ATG，同時(shí)上游加上保護(hù)性堿基TA，下游加上CG，降低G+C含量，防止二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，提高重組蛋白質(zhì)的表達(dá)含量。 取正常人新鮮外周血，提取單個(gè)核細(xì)胞，用本室配制RNA純化試劑盒分離純化細(xì)胞總RNA。以RNA為模板，隨機(jī)六聚體核苷酸為引物，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下進(jìn)行反應(yīng)，合成cDNA第一條鏈。 取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以P1P2為引物，用TaqDNA聚合酶，進(jìn)

13、行PCR，擴(kuò)增人NKp46基因。用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，接種于含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板上。用菌落PCR和限制性酶譜分析篩選出陽(yáng)性克隆。采用ABI3100-AvantGeneticAnalyzer基因分析儀進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，克隆的基因和預(yù)期的成熟人NKp46基因完全一致，成功構(gòu)建了NKp46重組質(zhì)粒pMD18-T-hNKp46。 2.人N

14、Kp46基因在大腸桿菌中的表達(dá)及重組蛋白的鑒定 用EcoRⅠ和NcoⅠ分別雙酶切重組載體pMD18-T-hNKp46和空載體pET30a(+)，再用1％瓊脂糖凝膠電泳分離純化，獲得目的基因片段hNKp46DNA及質(zhì)粒載體。利用T4DNA連接酶將基因片段hNKp46DNA與酶切處理載體pET30a(+)連接，使其插入到T7lac啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建表達(dá)重組子pET30a(+)-hNKp46。 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入非表達(dá)載體大腸桿

15、菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，然后接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)平板上37℃過(guò)夜培養(yǎng)。利用菌落PCR，初步篩選陽(yáng)性重組子。挑選陽(yáng)性克隆，接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)。采用樹(shù)脂法小量提取質(zhì)粒，然后用HindⅢ和BglⅡ雙酶切鑒定，確定定向插入的陽(yáng)性克隆。 準(zhǔn)備表達(dá)宿主菌株BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，然后用經(jīng)無(wú)菌水稀釋表達(dá)重組質(zhì)粒1μl(約1ng)，轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)，接種于含有卡那霉素LB培養(yǎng)平板上，37℃過(guò)夜培

16、養(yǎng)。從新鮮培養(yǎng)平板中挑取單克隆菌落，將含有pET30a(+)-hNKp46的BL21(DE3)表達(dá)宿主菌株(工程菌株)接種于含卡那霉素的50mlLB培養(yǎng)液中，于37℃搖床培養(yǎng)約3小時(shí)，至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。加入誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3-4小時(shí)，4℃4,000rpm5分鐘離心收集菌體。 采用SDS-PAGE電泳和WesternBlotting分析重組蛋白質(zhì)，用Bio-rad垂直電泳系統(tǒng)進(jìn)行。AlphaInnotechAlphamag

17、erTM2200凝膠圖像掃描系統(tǒng)分析，凝膠干燥儀干燥后保存。結(jié)果顯示，重組蛋白的表觀分子量為38.5kD，和文獻(xiàn)報(bào)道一致。重組蛋白約占菌體總蛋白的40％。 為研究重組hNKp46的生物學(xué)活性，進(jìn)行小規(guī)模的發(fā)酵。工程菌以1：100接種于含Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約0.5，加入IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4℃離心收集菌體，超聲破碎，離心分離上清和包涵體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析顯示重組蛋白存在于包涵體中。在變

18、性劑鹽酸胍存在的條件下，利用His·Bind純化試劑盒純化重組蛋白，透析去除鹽酸胍，PEG8000濃縮目的蛋白，并行SDS-PAGE電泳分析。 三、結(jié)論 1.成功克隆了人NKp46基因，序列分析顯示，克隆的基因序列和文獻(xiàn)報(bào)道一致。 2.構(gòu)建了成熟人NKp46的原核表達(dá)載體，獲得穩(wěn)定表達(dá)的工程菌株，重組蛋白約占菌體總蛋白的40％。 3.初步摸索優(yōu)化了重組hNKp46的表達(dá)條件。 4.獲得純化后的重組