人破骨細(xì)胞抑制性凝集素胞外段在大腸桿菌中的表達(dá)和生物活性分析.pdf

1、破骨細(xì)胞抑制性凝集素(Osteoclasstinhibitorylectin，OCIL)是由成骨細(xì)胞系/基質(zhì)細(xì)胞譜系表達(dá)的Ⅱ型跨膜蛋白，屬于C-類凝集素，具有抑制破骨細(xì)胞分化和成熟的功能?，F(xiàn)在對(duì)OCIL的研究剛剛開始，對(duì)它受體及其下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路和它的生物學(xué)功能還了解甚少。我們通過(guò)基因工程的研究方法，制備得到重組的OCIL活性蛋白，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究打下良好的基礎(chǔ)。 OCIL蛋白分為胞內(nèi)段、胞外段和跨膜區(qū)三個(gè)部分，胞外段含有C-

2、類凝集素的基序，是抑制破骨細(xì)胞形成的活性區(qū)域?；诖耍覀儜?yīng)用基因工程的方法，在大腸桿菌中表達(dá)OCIL胞外段重組蛋白，觀察重組蛋白對(duì)骨髓破骨細(xì)胞的形成的影響。 由于異源基因在原核系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，原核系統(tǒng)在翻譯過(guò)程對(duì)密碼子的選擇有偏嗜性，基于此，我們按照大腸桿菌密碼子偏嗜性和簡(jiǎn)并性原則，修改OCIL胞外段編碼序列的堿基序列，但是不改變OCIL的蛋白序列組成，通過(guò)重組PCR的方法得到連續(xù)、完整的OCIL胞外域DNA片段。借助克隆載體的

3、中介，目的片段連接于表達(dá)載體pMAL-c2x，轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)plysS表達(dá)宿主菌。重組質(zhì)粒在37℃、0.5mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，制備細(xì)胞抽提物，可溶部分和沉淀部分分別行SDS-PAGE，觀察到細(xì)胞裂解物上清和沉淀在預(yù)期分子量位置均有明顯的蛋白表達(dá)條帶。免疫印記Western-blotting顯示預(yù)期位置蛋白可與抗MBP抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，證明此重組蛋白確系MBP-OCIL重組融合蛋白。改變表達(dá)目的蛋白的溫度、時(shí)間和誘

4、導(dǎo)劑的濃度，優(yōu)化目的蛋白表達(dá)的條件，獲得最適的表達(dá)條件：表達(dá)溫度30℃，表達(dá)時(shí)間12小時(shí)，誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為0.3mM。利用融合蛋白中的擔(dān)體蛋白MBP可以與直鏈淀粉形成氫鍵的特點(diǎn)，使用直鏈淀粉親和層析柱，從BL21(DE3)plysS宿主菌表達(dá)的細(xì)胞裂解物上清中分離得到重組融合蛋白。通過(guò)透析的方法除去洗脫液中的洗脫劑麥芽糖、一些鹽離子和EDTA。BCA法測(cè)得透析液總蛋白濃度，透析液行SDS-PAGE還原凝膠電泳，UVP凝膠分析系統(tǒng)分

5、析純化后融合蛋白的純度。體外培養(yǎng)小鼠股骨骨髓細(xì)胞，在M-CSF和RANKL刺激骨髓細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的基礎(chǔ)上，加入不同濃度的重組融合蛋白MBP-OCIL，觀察重組MBP-OCIL對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用，抗酒石酸酸性磷酸酶染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)抗酒石酸酸性磷酸酶染色陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示我們所制備的重組融合蛋白MBP-OCIL對(duì)小鼠破骨細(xì)胞的形成有明顯的抑制作用(p＜0.05)，并且隨著慢MBP-OCIL濃度的增加，破骨細(xì)胞細(xì)胞數(shù)減少，MBP