ProNGF在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和復(fù)性的研究.pdf

1、摘要摘要神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactorNGF)是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，其生理作用十分廣泛，尤其在促進(jìn)神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化與成熟、維持神經(jīng)元的存活與損傷修復(fù)及再生等方面發(fā)揮著重要作用，它還參與免疫反應(yīng)，并具有促進(jìn)傷口愈合和血細(xì)胞生長，抑制腫瘤生長等作用。NGF在人體組織中含量極微，已有報導(dǎo)從胎盤中純化hNGF，但其組織來源極其有限，成本高產(chǎn)量低，不能滿足科研和臨床的需要，所以利用基因工程方法獲得大量有生物

2、學(xué)活性的NGF蛋白，對其基礎(chǔ)理論研究和臨床應(yīng)用具有深遠(yuǎn)的意義。目前，國內(nèi)己有研究者嘗試在不同的表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行重組表達(dá)，但是在表達(dá)產(chǎn)物中很難獲得活性較高的二聚體形式的蛋白。由于目前發(fā)現(xiàn)的絕大部分的以含前導(dǎo)膚的前體形式合成的蛋白質(zhì)，其前導(dǎo)膚都有幫助其正確折疊的作用，所以本研究對含前導(dǎo)膚的人NGF基因(proNGF)在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，并以此來探討NGF前導(dǎo)肚在輔助成熟膚的折疊及二硫鍵的配對過程中的作用。本論文的主要研究工作和結(jié)果如下:1

3、以pFastBacpreproNGF為模板，根據(jù)Genbank上提供的人NGF的基因序列和試驗需要設(shè)計出特異的引物，在目的蛋白基因的上游引入編碼腸激酶識別序列的堿基和NdeI酶切位點，用PCR的方法擴增出含前導(dǎo)膚的人NGF基因(proNGF)并克隆到pBST載體，對所構(gòu)建的重組子pBSTproNGF進(jìn)行分析鑒定。2把克隆的proNGF基因插入大腸桿菌表達(dá)載體pET15b中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET15bproNGF，將分析鑒定正確的重組子

4、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysSe3.用lmmoVLIPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，表達(dá)菌經(jīng)超聲破碎后離心，上清和沉淀分別進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測，目的蛋白以包涵體的形式存在，融合蛋白分子量大小約為30.2kDa，表達(dá)量占全菌總蛋白量的19.2%0AbstractAbstractNervegrowthfactorisoneofthemostimportantfactorswithbiologicalac

5、tivityplayinganimportantroleinregulatingthegrowthdevelopmentandsurvivaloftheneuronbutalsototheregenerationandtherehabilitationofthescathednervecells.Itcankeepthebalanceofthesystemsofneuralendocrineandimmunity.Theleveloft

6、heNGFinhumanbodyisverylow.FromthereportaboutthepurifiedNGFfromhumanplacentathetissuefromwhichwecanisolatetheNGFwithbiologicalactivityisverylimitedbutalsoitsproductistoolowtomeettheneedsoftheNGFforpeople.Soithasgreatsigni

7、ficancetoisolateNGFwithnativestructureandbiologicalactivity勿geneticengineeringforitstheoryresearchandclinicapplication.Recombinanthumannervegrowthfactorhasbeenproducedindiferentexpressionsystembuttherecombinantpreparatio

8、nsappeartobelessactivethannaturallyoccurringNGFfordimmersaredificulttobeobtained.InvivoNGFissynthesizedasaninactiveprecursor(preproprotein)includingsignalpeptidepropeptideandmaturepeptide.Thepresequencemediatestranslocat

9、ionintotheendoplamicreticulum.Therecentstudiesdemonstratedthatmanyproteinsaresynthesizedasprecursorswithproregionsinvivowhichprosequenceareknowntopromoterefoldingofthematurepart.SowespeculatethatthiscouldbetureforNGF.Int

10、hisstudythesequenceofprodomainandmaturedomainthatencodesNGFwasclonedintothepET15bandtheresultingconstructwasintroducedintoE.colLBL2I(DE3)pLysSforexpression.Thefollowingarethemainresearchcontentsandresults:1.Bypolymerasec