抗哈維弧菌單克隆抗體的制備、特性分析與應(yīng)用.pdf

1、 分類號 分類號 密 級 U D C 編 號 碩 士 學(xué) 位 論 文 抗哈維弧菌單克隆抗體的制備、特性 分析與應(yīng)用 李洋 （1114022） 指導(dǎo)教師姓名 李 強 副教授 李 華 教授 專 業(yè) 名 稱 水產(chǎn)養(yǎng)殖

2、 論文答辯日期 2014 年 6 月 3 日 學(xué)位授予日期 2014 年 7 月 摘要 I 摘 要 哈維弧菌 H06091 是分離自大連養(yǎng)殖紅鰭東方鲀皮膚潰瘍病的致病菌。目前針對該菌的檢測方法耗時長，操作復(fù)雜，需要專業(yè)人員操作，不利于現(xiàn)場檢測的推廣。單克隆抗體介導(dǎo)的免疫學(xué)檢測方法特異性強，靈敏度高，得到了廣泛應(yīng)用。 本試驗用甲醛滅活的哈維弧菌 H06091 免疫

3、 Balb/C 小鼠，采用單克隆抗體技術(shù)經(jīng)細(xì)胞融合、篩選和有限稀釋法克隆，制備了 19 株穩(wěn)定分泌抗哈維弧菌 H06091 的單克隆抗體，分別命名為 1B6、 1D6、 1A4、 5B4、 6C6、 2E7、 4A7、 5B2、 4E12、 1G3、 7D7、 8E10、 4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6 和 2C1。對這 19 株單抗進行了特性分析。特異性分析使用了燦爛弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、美人魚弧菌、

4、鰻弧菌、希瓦氏菌、河豚鏈球菌、殺鮭氣單胞菌、遲緩愛德華菌、2 株哈維弧菌等參考菌株和 5 株哈維弧菌分離菌株，其中單克隆抗體 4A7、 4E12、 7D7、 8E10、 4D12 和 2B9 特異性良好； 單克隆抗體 2E7、 5B2、1G2、2C1 和 1G3 與部分菌株有交叉反應(yīng)；而單克隆抗體 1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6 和 6G6 特異性較差。對單抗 4A7、4E12、7D7、8E10、4D12、2B9

5、、2E7、5B2、1G2 和 2C1 進行亞型分析，其中單抗 7D7 和 8E10 為 IgG 亞型，而其余 8 株單抗為 IgM 亞型。對單抗 4A7、4E12、7D7、8E10、4D12、2B9、2E7、5B2、1G2 和 2C1 進行效價和靈敏度分析，單抗的效價在 1:4 到 1:1024 之間；單克隆抗體檢測哈維弧菌的靈敏度最低可達(dá)到 5×105cells/mL。所有抗體的穩(wěn)定性強。 選取單克隆抗體 8E10 建立了哈

6、維弧菌的雙抗體夾心 ELISA 快速檢測方法，通過棋盤滴定法確定了多克隆抗體的最佳包被濃度為 1:12800， 單克隆抗體的最佳工作濃度為 1:128，堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的羊抗小鼠 Ig 稀釋度為 1:2000。該檢測方法的特異性強，可以特異的檢測哈維弧菌 H06091， 與試驗用到的其他參考菌株均無交叉反應(yīng)； 該檢測方法的靈敏度可以達(dá)到 5×106cells/mL。 哈維弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的致病菌，可引起多種水產(chǎn)動物爆