抗鴨IgY Fc片段單克隆抗體的制備.pdf

1、IgY是鴨體內(nèi)中主要的免疫球蛋白分子之一，其在鴨體內(nèi)有兩種形態(tài)的分子，即完整型IgY分子和缺失型IgY分子。本課題研究目的在于制備抗鴨IgY Fc片段CH3-CH4單克隆抗體，這樣就能夠檢測(cè)出鴨血清中完整型IgY分子。此外抗鴨IgY Fc片段CH2的單克隆抗體可以既可以檢測(cè)到缺失型IgY分子也可以檢測(cè)完整型IgY分子。
　　 1、鴨IgY Fc片段CH2-CH3-CH4基因的克隆與序列分析
　　 以BSA免疫櫻桃谷肉鴨的

2、脾臟提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增含有CH1部分序列的IgY Fc片段CH1-CH2-CH3-CH4，大小為1154bp，將目的基因與T載體連接，pMD-18T-CH1-CH2-CH3-CH4重組質(zhì)粒測(cè)序分析結(jié)果表明在CH2-CH3-CH4基因中存在4個(gè)堿基的突變，核苷酸同源性為99％，其突變均為無(wú)義突變，氨基酸同源性為100％。以此為模板擴(kuò)增CH2-CH3-CH4基因，大小為954bp。
　　 2、鴨IgY Fc片段CH2，

3、CH3-CH4及CH1-CH2-CH3-CH4基因的原核表達(dá)
　　 以pMD-18T-CH1-CH2-CH3-CH4為模板成功擴(kuò)增CH2，CH3-CH4，CH1-CH2-CH3-CH4基因，大小分別為288bp，666bp和1154bp。將目的基因分別與原核表達(dá)載體連接構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-KG-CH1-CH2-CH3-CH4，pET-28a-CH2，pET-28a-CH3-CH4。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GS

4、T-CH1-CH2-CH3-CH4，大小約為48KDa，經(jīng)Western blot鑒定后將純化表達(dá)蛋白進(jìn)行Balb/c小鼠的免疫，制備單克隆抗體。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白His-CH2和His-CH3-CH4，大小分別為17KDa和26KDa。經(jīng)Western blot鑒定后將純化蛋白作為包被抗原用于單克隆抗體的篩選。
　　 3、抗鴨IgY Fc片段單克隆抗體的制備
　　 用純化的融合蛋白GST-CH1-