抗豬圓環(huán)病毒Ⅱ型單克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、本試驗(yàn)通過在PK15細(xì)胞上增殖PCV2。濃縮純化后，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)得在280nm和260nm處的吸光度，根據(jù)公式計(jì)算得PCV2濃縮純化后抗原的總蛋白濃度為：Pro(PCV2)=25.1970 mg/ml。 在抗原中加入等體積的完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，分別制成完全佐劑抗原和不完全佐劑抗原，免疫8周齡Balb/c小鼠。三免過后，腹腔超強(qiáng)免疫一次，取小鼠的脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)自行建立的間接ELISA方法檢測(cè)

2、篩選，獲得3株穩(wěn)定分泌抗PCV2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，依次命名為2B5、2D4、3C3。 最終確定ELISA的最佳工作條件為：包被抗原量為25μg/ml，包被液為CBS(PH9.6、0.05M)，包被時(shí)間為37℃1h再4℃過夜，封閉物為1％的明膠，酶標(biāo)二抗做1:1000稀釋。 對(duì)篩選的陽性克隆進(jìn)行特異性鑒定，結(jié)果表明：PCV2能有效地阻斷雜交瘤細(xì)胞上清，競(jìng)爭(zhēng)抑制率最高可達(dá)80％以上；用PRRS、PPV、PRV代替阻斷

3、試驗(yàn)中的PCV2，阻斷前后的OD值沒有明顯的變化，說明沒有交叉反應(yīng);用純化的抗原包被，豬2型圓環(huán)病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果顯陽性;把PK15細(xì)胞按照抗原處理的方法做相同處理，然后包被板子或用細(xì)胞培養(yǎng)液包被，陽性雜交瘤細(xì)胞上清檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果均顯陰性。以上試驗(yàn)結(jié)果均說明，篩選的陽性克隆特異性良好。 經(jīng)檢測(cè)，抗PCV2單抗的雜交瘤細(xì)胞上清及小鼠腹水單抗的ELISA效價(jià)最高可達(dá)1:512和1:102400。各株雜交瘤細(xì)胞的平均染色體數(shù)目

4、在92-108之間，基本符合SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)目與正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目之和。經(jīng)過連續(xù)傳代25次和三次凍融復(fù)蘇，雜交瘤細(xì)胞抗體分泌能力有輕微下降，但仍能穩(wěn)定分泌抗體。 利用腹水單抗建立了檢測(cè)PCV2的雙夾心間接ELISA方法。經(jīng)鑒定，豬源抗PCV2高免血清抗體的效價(jià)是1:3200，用時(shí)做1:3200稀釋；PCV2腹水單抗的效價(jià)是1:102400，用時(shí)做1:1600稀釋，檢測(cè)靈敏度為80.63ng/ml。此外還建立了檢測(cè)