抗RecQ解旋酶單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、目的：利用雜交瘤技術(shù)制備高特異性、高效價(jià)的抗RecQ解旋酶單克隆抗體（McAb）并對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，為腫瘤的研究和治療提供條件。
　　方法：對(duì)純化的重組大腸桿菌RecQ解旋酶進(jìn)行性質(zhì)鑒定后，作為免疫原免疫Balb/c小鼠，將其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，采用甲基纖維素半固體法及有限稀釋法同時(shí)對(duì)融合的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆篩選，結(jié)合間接 ELISA法篩選出可分泌抗RecQ解旋酶單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并將

2、其注入未免疫的經(jīng)液體石蠟預(yù)處理的Balb/c小鼠體內(nèi)誘生腹水，同時(shí)收集雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液及腹水進(jìn)行單克隆抗體的鑒定。用秋水仙素阻斷法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析；用間接ELISA法和Western-Blot法測(cè)定單克隆抗體特異性，用間接ELISA法鑒定單克隆抗體的Ig亞型、效價(jià)；將系列梯度稀釋的抗RecQ解旋酶單克隆抗體與RecQ解旋酶結(jié)合后，再加入熒光素標(biāo)記的雙鏈DNA，用熒光偏振儀檢測(cè)RecQ解旋酶結(jié)合DNA的活性，觀察抗Rec

3、Q解旋酶單克隆抗體對(duì)RecQ解旋酶活性的抑制作用。
　　結(jié)果：應(yīng)用甲基纖維素半固體法及有限稀釋法，各成功獲得1株能穩(wěn)定分泌抗RecQ解旋酶單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別編號(hào)為6H5、1C1。兩株雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目均在94-104；其分泌的單克隆抗體類型均為 IgG1型；收集生長(zhǎng)良好的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液或?qū)⑵浣臃N到液體石蠟預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔中制備腹水型單抗，其中6H5株所得上清液和腹水中抗體效價(jià)分別為1/103和1/1

4、07；1C1株所得上清液和腹水中抗體效價(jià)分別為1/103和1/105；間接 ELISA法和Western blot檢測(cè)結(jié)果證明兩株雜交瘤細(xì)胞所分泌的單克隆抗體能特異性結(jié)合RecQ解旋酶；將兩株單克隆抗體梯度稀釋后分別與RecQ解旋酶結(jié)合，經(jīng)熒光偏振測(cè)定儀檢測(cè)RecQ解旋酶結(jié)合DNA的活性，結(jié)果顯示抗RecQ解旋酶單克隆抗體與RecQ解旋酶抗原在比例合適時(shí)，可抑制RecQ解旋酶的結(jié)合DNA活性。
　　結(jié)論：利用純化的重組大腸桿菌Re