紫杉醇單克隆抗體的制備與應(yīng)用.pdf

1、1975年兩位生物分子學(xué)家Kohler和Milstein利用經(jīng)過免疫的小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，建立了能分泌針對(duì)特定抗原產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞株，標(biāo)志著單克隆抗體技術(shù)的誕生。所謂單克隆抗體（簡(jiǎn)稱單抗），是指由單個(gè)B細(xì)胞克隆化所分泌的只識(shí)別一個(gè)抗原決定簇的完全均一抗體。單克隆抗體的問世，既帶動(dòng)了免疫學(xué)領(lǐng)域的一次革命，又對(duì)生物醫(yī)學(xué)等多種學(xué)科的發(fā)展產(chǎn)生了重大影響。
　　技術(shù)單克隆抗體的制備方法分為雜交瘤技術(shù)和基因工程技術(shù)。雜交瘤技術(shù)是目

2、前使用最廣泛的抗體制備方式，該法主要包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選三個(gè)環(huán)節(jié)，制備出的抗體具有高親和力、高靈敏度、可大規(guī)模成產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于物質(zhì)的檢測(cè)、分離工作?；蚬こ炭贵w技術(shù)種類很多，包括嵌合抗體技術(shù)、重構(gòu)抗體技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、基因工程小鼠制備抗體技術(shù)等。
　　隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，單抗已經(jīng)在眾多領(lǐng)域中得到了應(yīng)用。單抗應(yīng)用最多的領(lǐng)域是臨床疾病的診斷，其在淋巴細(xì)胞鑒別、病原體鑒定、寄生蟲檢測(cè)、腫瘤診斷和

3、分型、激素檢測(cè)方面有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。人源化單抗可用于臨床治療，其在自身免疫性疾病、心血管疾病、癌癥等疾病的治療上得到了廣泛應(yīng)用。此外，單抗還可應(yīng)用于食品中有害物質(zhì)的檢測(cè)，生藥研究中的小分子活性成分的檢測(cè)、分離、純化及與毒性物質(zhì)的中和。
　　免疫分析法是單克隆抗體應(yīng)用中一項(xiàng)非常重要的領(lǐng)域。它是基于抗原與抗體的特異性反應(yīng)，同時(shí)采取酶或其他有色或發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體從而進(jìn)行定性或定量檢測(cè)，其特異性和靈敏度要遠(yuǎn)高于一般的理化方法。目前應(yīng)用較

4、多的免疫分析法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，包含雙抗夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法三種常用的方法。它具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、樣品前處理要求低、檢測(cè)迅速高效、無環(huán)境污染、設(shè)備投入低等優(yōu)點(diǎn)，適合推廣應(yīng)用。
　　生藥活性物質(zhì)一般屬于半抗原，需要在半抗原上偶聯(lián)特定的大分子物質(zhì)作為載體才能構(gòu)成完全抗原，刺激機(jī)體發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體。與半抗原偶聯(lián)的載體一般為蛋白質(zhì)，如牛血清蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、雞卵清蛋白

5、(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、鑰匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)，也有其他大分子物質(zhì)，如多聚賴氨酸(PLL)。
　　紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離出來的一種三環(huán)二萜化合物，具有獨(dú)特的誘導(dǎo)微管蛋白聚合而抑制細(xì)胞分裂的抗腫瘤機(jī)制。紫杉醇在1992年被美國食品與藥物管理局(FAD)批準(zhǔn)作為抗晚期癌癥的新藥上市，到目前為止仍然是治療乳腺癌、子宮癌、卵巢癌等癌癥的臨床一線用藥。由于紫杉醇的市場(chǎng)需求量不斷增大，其成產(chǎn)的主要原料紅豆杉又屬于稀缺資源

6、，再加上它在植物中的含量極低，因此紫杉醇醫(yī)療價(jià)值和研究?jī)r(jià)值有著很大的上升潛力。
　　準(zhǔn)確高效的檢測(cè)方法是紫杉醇研究中必不可少的。當(dāng)前用于紫杉醇檢測(cè)的方法有薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、超臨界流體色譜法，質(zhì)譜法，生物化學(xué)方法，其中應(yīng)用最廣泛的方法是高效液相色譜法。這些方法盡管有些具有某方面的優(yōu)勢(shì)，但總體上存在著設(shè)備投入高、操作復(fù)雜、樣品前處理復(fù)雜、時(shí)間消耗長(zhǎng)等缺點(diǎn)，而免疫檢測(cè)技術(shù)在許多天然藥物的質(zhì)量控制中已經(jīng)得到了應(yīng)用，

7、并顯示出其靈敏度高，設(shè)備投入低，方便快捷等方面的優(yōu)勢(shì)，因此，本研究嘗試?yán)妹庖邫z測(cè)技術(shù)用于紫杉醇物質(zhì)的檢測(cè)。
　　本研究報(bào)道的是一種紫杉醇單克隆抗體的制備及應(yīng)用該單抗建立用于紫杉醇檢測(cè)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。該方法適合用于有關(guān)紫杉醇的質(zhì)量控制和若干研究，且在某些方面優(yōu)于以往報(bào)道的紫杉醇免疫檢測(cè)法。
　　紫杉醇是小分子物質(zhì)(Mr=853.93)，屬于半抗原，并且由于紫杉醇分子上缺少能與載體蛋白結(jié)合的基團(tuán)，我們采用7-木糖基紫

8、杉醇與牛血清白蛋白(BSA)合成抗原復(fù)合物，利用基質(zhì)輔助激光飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF MS)檢測(cè)木糖基紫杉醇-BSA抗原復(fù)合物中半抗原的數(shù)目。用此抗原復(fù)合物對(duì)2只BALB/c雌性小鼠進(jìn)行免疫，免疫過程中對(duì)小鼠的抗血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定與抗體特異性測(cè)定。選擇抗血清效價(jià)較高的免疫小鼠，取其脾臟細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞株融合，使用有限稀釋法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞系，通過小鼠腹腔接種法進(jìn)行單克隆抗體的大量生產(chǎn)，利用鹽析法結(jié)合proteinG層析柱

9、純化抗體。獲得的單抗命名為3A3，該抗體類型為IgG1并且?guī)в笑瘦p鏈，對(duì)紫杉醇有很強(qiáng)的親和力，與其他天然的紫杉烷類交叉反應(yīng)分別為:7-木糖基紫杉醇，31.8％;三尖杉寧堿，6.17％;巴卡亭Ⅲ、10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ、1-羥基巴卡亭Ⅰ、13-乙酰-9-二氫巴卡亭Ⅲ和1-乙酰氧基-5-去乙?；?巴卡亭Ⅰ，＜0.11％）。使用該抗體建立了用于紫杉醇檢測(cè)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，檢測(cè)限是0.0098-0.3125μg/mL，并將此法應(yīng)用于紅豆杉的樹

10、皮、根、枝葉樣品的檢測(cè)。紅豆杉樣品檢測(cè)方法的回收率是92％-94.8％，板內(nèi)和板間檢測(cè)的變異分別是3.6％和4.7％，該間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA為多種不同目的的紫杉醇檢測(cè)提供了一個(gè)很有價(jià)值的方法。
　　我們建立的用于檢測(cè)紫杉醇的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA比HPLC更具有實(shí)用性，即不需要高端儀器，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下就可操作。使用該方法可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本，且樣品不需要復(fù)雜前處理，有機(jī)溶劑使用極少，顯示出了其低成本、高效率、操作簡(jiǎn)便性、環(huán)保等方面的優(yōu)

11、勢(shì)。
　　制備紫杉醇免疫復(fù)合物采用的紫杉醇衍生物是7-木糖基紫杉醇，這比以往報(bào)道的方法要簡(jiǎn)單得多，因?yàn)?-木糖基紫杉醇是天然的紫杉醇衍生物，可直接從市場(chǎng)購買，省去了紫杉醇衍生物合成過程，使得紫杉醇完全抗原合成程序更加方便快捷。
　　從本研究獲得的單抗3A3與缺少C-13側(cè)鏈的巴卡亭類紫杉烷無交叉反應(yīng)，從該交叉反應(yīng)特性來看，推測(cè)單抗的抗原決定簇位于C-13側(cè)鏈的遠(yuǎn)側(cè)。這在一定程度上解決了現(xiàn)有紫杉醇免疫檢測(cè)方法中的缺陷。