抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、禽流感（AI）是由A型流感病毒引起的一種禽類的烈性傳染病。自1878年意大利首先發(fā)現(xiàn)至今，世界各地都有特定毒株引起的禽流感爆發(fā)和流行。尤其是高致病力禽流感可導致高達100％發(fā)病率和／或死亡率。并可直接感染人并致人死亡。而低致病力禽流感病毒同樣可以給養(yǎng)禽業(yè)帶來滅頂之災，對人類的威脅同樣嚴重，目前，高致病性禽流感（HPAI）已被國際獸疫局規(guī)定為A類動物傳染病。其防制已直接關系到養(yǎng)禽業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展和人民的身體健康。 豬流感病毒（SI

2、V）最突出的流行病學特點是同時具有感染人、禽的潛力，而且豬可最大限度地被AIV和人流感病毒感染。因此，對SI的監(jiān)測作為預測和防止流感大暴發(fā)的最重要手段早已在歐美國家引起關注并達成共識。 A型流感病毒亞型眾多，易變。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了16種H亞型和10種N亞型，從而導致該病的診斷和治療非常困難。國內(nèi)對流感病毒的臨床診斷主要是對抗體的檢測。我國許多養(yǎng)雞場使用禽流感滅活苗，如何區(qū)分免疫雞群與感染雞群卻成為當前面臨的一大難題因此，迫切需要

3、一種較為理想的禽流感診斷方法。流感病毒的HA和NA蛋白容易變異，但NP蛋白卻相對保守。因此，利用NP蛋白和HA蛋白分別有望建立一種所有亞型禽流感病毒的檢測方法和診斷流感病毒亞型的方法。本研究利用雜交瘤技術獲得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3 HA的單抗，為對流感病毒的進一步研究和建立針對流感病毒的檢測方法奠定基礎。主要研究內(nèi)容包括： 分別用甲醛滅活的和Triton x-100裂解的禽流感H9N2病毒，禽流感病毒NP基因的原核表達產(chǎn)物

4、免疫Balb／c小鼠，取免疫脾細胞與SP2／0骨髓瘤細胞融合。經(jīng)間接ELISA篩選，3次有限稀釋法克隆。共得到6株能穩(wěn)定分泌抗禽流感病毒NP蛋白抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為4F4、1C3、1G11、1C2、1D10、2E7。經(jīng)3次亞克隆后，100％的雜交瘤細胞保持了分泌抗禽流感病毒NP蛋白抗體的能力。染色體計數(shù)結(jié)果表明所有雜交瘤細胞確實為脾細胞與SP2／0細胞的雜交產(chǎn)物。間接免疫熒光說明單抗的結(jié)合活性很好。其中1G11、1D10單克隆

5、抗體小鼠腹水的效價最高，ELISA效價分別為2<'13>×100和2<'14>×100。單克隆抗體1G11、1D10分別為IgG1、IgG2a亞類。 研究結(jié)果表明，1G11、1D10單克隆抗體與禽流感病毒的NP蛋白能發(fā)生特異性反應，而不與新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV）、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒（EDS-76）、禽腺病毒1型（APMV-1）發(fā)生反應。單克隆

6、抗體的獲得為禽流感病毒的研究及快速診斷方法的建立奠定了基礎。 用H3N8病毒免疫Balb／c小鼠，取免疫脾細胞與SP2／0骨髓瘤細胞融合。經(jīng)血凝抑制（HI）篩選，3次有限稀釋法克隆。共得到3株能穩(wěn)定分泌抗禽流感病毒HA蛋白抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為2B7、1C11、4G7。經(jīng)3次亞克隆后，100％的雜交 瘤細胞保持了分泌抗H3N8 HA蛋白抗體的能力。染色體計數(shù)結(jié)果表明所有雜交瘤細胞確實為脾細胞與SP2／0細胞的雜交

7、產(chǎn)物。間接免疫熒光說明單抗的結(jié)合活性很好，單克隆抗體287、1C11、4G7／小鼠腹水的血凝抑制價為2<'12>、2<'8>、2<'7>；ELISA效價分別為2<'11>×100、2<'8>x100、2<'7>x100。單克隆抗體287、1C11、4G7分別為IgG2a、IgG1、IgG2a亞類。 研究結(jié)果表明，287、1C11、4G7單克隆抗體與H3N8流感病毒的HA蛋白能發(fā)生特異性反應，而不與其他亞型流感病毒反應。單克隆抗體