抗豬囊尾蚴頭節(jié)單克隆抗體的制備、特性鑒定及初步應(yīng)用.pdf

1、豬囊尾蚴病是危害最為嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病之一，該病不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。人不僅是中間宿主，而且是唯一的終末宿主。囊尾蚴常在腦、眼、心臟等重要器官寄生，其中以寄生于神經(jīng)系統(tǒng)的腦囊蟲病引起的臨床癥狀最為嚴(yán)重，極大危害了人類健康。研制簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的診斷力一法及診斷試劑己成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外專家攻克該病工作的重點(diǎn)。本研究的目的是，制備穩(wěn)定產(chǎn)生抗豬囊尾蚴頭節(jié)抗原的雜交瘤細(xì)胞株及相應(yīng)單抗，鑒定細(xì)胞株的生物學(xué)特性，建立

2、了特異、準(zhǔn)確檢測(cè)豬囊尾蚴頭節(jié)蛋白雙抗體夾心ELISA法，并進(jìn)行了初步應(yīng)用。 方法：采用SephadexG-200層析純化豬囊尾蚴頭節(jié)，用豬囊尾蚴頭節(jié)抗原免疫BALB/c小鼠4次，每次免疫間隔2周，融合前三天豬囊尾蚴頭節(jié)抗原尾靜脈注射進(jìn)行攻擊。取免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株Sp2/0，用50％聚乙二醇PEG融合，HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)出融合細(xì)胞。建立間接ELISA方法，初篩分泌抗豬囊尾蚴頭節(jié)抗體的融合細(xì)胞，有限稀釋法克隆化培養(yǎng)獲得穩(wěn)定分

3、泌單抗的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞注入BALB/c小鼠腹腔，制備腹水，采用飽和硫酸銨沉淀法純化腹水，SDS-PAGE凝膠電泳鑒定McAb純度；間接ELISA測(cè)定單抗的效價(jià)；采用間接法ELISA進(jìn)一步鑒定了mAb的特異性，用豬囊尾蚴頭節(jié)蛋白免疫新西蘭白兔制備抗豬囊尾蚴頭節(jié)血清以SAS沉淀法純化IgG。用純化的抗豬囊尾蚴頭節(jié)的單抗與多抗，建立單抗一多抗雙夾心ELISA法，檢測(cè)不同稀釋濃度的豬囊尾蚴頭節(jié)蛋白，確定檢測(cè)的敏感性；檢測(cè)與豬

4、囊尾蚴囊液、囊壁的交叉反應(yīng)性，確定檢測(cè)的特異性。 結(jié)果：經(jīng)細(xì)胞融合、HAT選擇培養(yǎng)、抗體檢測(cè)篩選、克隆化培養(yǎng)得到三株穩(wěn)定分泌抗豬囊尾蚴頭節(jié)單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2C6、3A5和4G10，細(xì)胞株穩(wěn)定性較好，體外連續(xù)傳30代、液氮中凍存3個(gè)月后復(fù)蘇測(cè)定，細(xì)胞株仍可穩(wěn)定分泌單抗。腹水型單抗中，2C6效價(jià)較高達(dá)1：6.4×10<'4>，3A5和4G10效價(jià)達(dá)1:1.6×10<'3>、1：3.2×10<'3>。除2C6分泌的單抗的

5、Ig類別為IgG1外，其余均為IgG2a。雙抗體夾心法采用一株抗豬囊尾蚴頭節(jié)單克隆抗體(2C6)為包被抗體，以識(shí)別和結(jié)合待檢標(biāo)本中的豬囊尾蚴頭節(jié)抗原，兔抗豬囊尾蚴頭節(jié)多抗可與頭節(jié)蛋白分子的另外表位結(jié)合，后加入HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為酶標(biāo)抗體，并催化底物顯色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待檢標(biāo)本中的頭節(jié)蛋白含量，建立了豬囊尾蚴頭節(jié)的雙抗體夾心ELISA法。標(biāo)準(zhǔn)品中頭節(jié)蛋白含量在1ng/mL-10g