體細(xì)胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的研究.pdf

1、全世界有190多個(gè)國(guó)家飼養(yǎng)奶山羊，我國(guó)是奶山羊存欄量最多的國(guó)家。但我國(guó)奶山羊個(gè)體的年均奶產(chǎn)量普遍偏低。如何改良奶山羊品種，提高奶山羊的個(gè)體產(chǎn)奶量已成為畜牧工作者亟需解決的問題。生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）在乳腺發(fā)育和泌乳過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。GH不僅可以促進(jìn)乳腺發(fā)育，而且能維持泌乳期乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而增加奶產(chǎn)量。因此，本研究選用GH作為目的基因，通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)培育高產(chǎn)奶量的轉(zhuǎn)基因奶山羊新品種。
　　首

2、先，通過(guò)分子克隆技術(shù)，利用β-LG基因啟動(dòng)子元件構(gòu)建能夠在乳腺中特異性表達(dá)GH的載體pcGH，然后將載體轉(zhuǎn)染到分離培養(yǎng)純化的乳腺上皮細(xì)胞中，驗(yàn)證該載體能在體外分離的乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)GH;其次，采用電轉(zhuǎn)染的方法將線性化的載體pcGH轉(zhuǎn)染到分離培養(yǎng)的山羊胎兒成纖維細(xì)胞中，通過(guò)G418藥物篩選轉(zhuǎn)GH基因陽(yáng)性細(xì)胞。進(jìn)一步將轉(zhuǎn)GH基因陽(yáng)性細(xì)胞移植到去核的卵母細(xì)胞中，經(jīng)融合激活待其發(fā)育到囊胚或桑椹胚后，移植到代孕母羊子宮中生產(chǎn)F0代克隆奶山羊;再

3、次，通過(guò)普通PCR、Southern-blot、熒光定量PCR和TAIL-PCR等技術(shù)方法檢測(cè)了外源基因在F0代克隆羊基因組中的整合情況;最后，為了評(píng)估轉(zhuǎn)入的GH基因?qū)δ躺窖虻挠绊?，?duì)F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的生長(zhǎng)發(fā)育、生理情況、乳腺發(fā)育及產(chǎn)奶量等生產(chǎn)性能進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，同時(shí)為了評(píng)估轉(zhuǎn)GH基因奶山羊羊奶的安全性，將F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊羊奶飼喂羔羊，跟蹤檢測(cè)小羊的生長(zhǎng)發(fā)育及生理情況，以期獲得高產(chǎn)奶量的轉(zhuǎn)基因奶山羊。主要試驗(yàn)內(nèi)容分為以下四個(gè)部

4、分:
　　1、山羊乳腺特異性表達(dá)載體pcGH的構(gòu)建及其驗(yàn)證
　　本部分試驗(yàn)的研究目的是構(gòu)建能夠在山羊乳腺中特異性表達(dá)的載體pcGH，并在體外分離培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細(xì)胞中驗(yàn)證其生物學(xué)功能。首先，以薩能奶山羊?yàn)椴牧?，從山羊的血液中提取基因組，采用PCR的方法克隆得到包含山羊β-乳球蛋白啟動(dòng)子區(qū)、外顯子1在內(nèi)的5'端調(diào)控序列(β-LG5)和包含外顯子6、7及終止子在內(nèi)的3'端調(diào)控序列(β-LG3)，同時(shí)利用RT-PCR的方法，從山

5、羊的腦垂體中，克隆得到山羊gh基因;其次，以真核表達(dá)載體pV為骨架載體，先將克隆得到的β-LG5基因插入到XhoⅠ位點(diǎn)處，然后再將gh基因插入到β-LG5基因的下游末端EcoRⅠ位點(diǎn)處，再將克隆的β-LG3基因克隆到gh基因的下游末端SalⅠ位點(diǎn)處，構(gòu)建乳腺特異性表達(dá)載體并命名為pcGH。經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證載體構(gòu)建正確，且測(cè)序結(jié)果無(wú)堿基突變，說(shuō)明乳腺特異性表達(dá)載體pcGH構(gòu)建正確。為了驗(yàn)證所構(gòu)建的載體能夠在乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，我們通過(guò)組

6、織塊培養(yǎng)法從泌乳期的乳腺中分離山羊乳腺上皮細(xì)胞，并通過(guò)差異消化法對(duì)乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行純化，純化的細(xì)胞經(jīng)免疫組化的方法驗(yàn)證其為上皮細(xì)胞;最后，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將乳腺特異性表達(dá)載體pcGH轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞中。于48h、60h、72h分別收集細(xì)胞上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染pcGH到山羊乳腺上皮細(xì)胞48h后，GH表達(dá)量極顯著高于未轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)，而60 h、72 h GH表達(dá)量有所下降，但仍顯著高于未轉(zhuǎn)

7、染組(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，乳腺特異性表達(dá)載體peGH能在培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)GH蛋白。這些結(jié)果為下一步制備在乳腺中特異性表達(dá)GH的轉(zhuǎn)基因奶山羊提供了保障。
　　2、轉(zhuǎn)GH基因陽(yáng)性克隆細(xì)胞的篩選及轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的制備
　　本部分研究的目的是分離培養(yǎng)山羊胎兒成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染并篩選轉(zhuǎn)GH基因陽(yáng)性克隆細(xì)胞，同時(shí)用激素超排的方法獲得卵母細(xì)胞，通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)GH基因奶山羊。首先，通過(guò)組織塊培養(yǎng)法，分離培養(yǎng)了山

8、羊胎兒成纖維細(xì)胞，PCR方法鑒定分離的山羊胎兒成纖維細(xì)胞為雌性。然后使用電轉(zhuǎn)染的方法，將線性化的山羊GH乳腺特異性表達(dá)載體pcGH轉(zhuǎn)染到山羊胎兒成纖維細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染48 h后，更換培養(yǎng)基添加G418（500μg/mL）進(jìn)行抗性篩選，在12d左右出現(xiàn)明顯的克隆團(tuán)。挑取單克隆細(xì)胞團(tuán)傳至48孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)將G418濃度減半，待細(xì)胞長(zhǎng)至80％-90％時(shí)，收集細(xì)胞，經(jīng)PCR驗(yàn)證共獲得GH陽(yáng)性細(xì)胞65個(gè)。饑餓處理后，凍存作為核移植的供體細(xì)胞;

9、其次，采用超排處理，從37只供體母羊中共獲取卵母細(xì)胞388枚，作為核移植的受體細(xì)胞;核移植后供融合卵數(shù)337枚，融合卵數(shù)264枚，融合率為78.34％,激活后獲得重構(gòu)胚254枚。其中115枚重構(gòu)胚直接移植到受體羊輸卵管中，共移植受體羊17只;另138枚重構(gòu)胚用瓊脂包埋，先移植到寄母羊輸卵管中，體內(nèi)培養(yǎng)5d后，回收胚126枚，其中發(fā)育到囊胚期64枚，將胚移植受體母羊子宮中，共移植39只，每只移植1-2枚。合計(jì)移植56只受體羊，至35 d檢

10、測(cè)有26只懷孕。最后，獲得6只存活的克隆羊。這些結(jié)果為下一步轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的鑒定奠定了基礎(chǔ)。
　　3、轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的鑒定
　　本研究的目的是對(duì)前期研究獲得的F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊外源基因整合的情況進(jìn)行鑒定和分析。首先，通過(guò)普通PCR和Southern-blot的方法檢測(cè)，構(gòu)建的乳腺特異性表達(dá)pcGH在F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊基因組中的整合情況;其次，再通過(guò)絕對(duì)熒光定量PCR和熱不對(duì)稱交互式PCR(TAIL-PCR)的方法

11、來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)GH基因拷貝數(shù)和整合位點(diǎn);最后，采用旁側(cè)PCR對(duì)獲得的整合位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。PCR和Southern-blot結(jié)果表明，所獲得的克隆羊均整合有轉(zhuǎn)GH基因構(gòu)件;熒光定量PCR結(jié)果表明:GHcd-2、GHcd-7轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的拷貝數(shù)分別為12.95±0.18、12.24±1.12。TAIL-PCR檢測(cè)結(jié)果表明:經(jīng)BLAST比較分析，GHcd-2、GHcd-7兩只轉(zhuǎn)GH基因奶山羊外源基因分別整合到基因組3號(hào)和11號(hào)染色體上。這些結(jié)果為

12、轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的安全性評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。
　　4、轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的初步安全性評(píng)價(jià)
　　本研究的目的是在前期對(duì)F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的拷貝數(shù)及整合位點(diǎn)鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)入GH基因的奶山羊自身安全性及轉(zhuǎn)GH基因奶山羊羊奶的安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。首先，通過(guò)對(duì)F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的生長(zhǎng)發(fā)育性能進(jìn)行跟蹤觀察和測(cè)定，研究外源基因?qū)δ躺窖蜃陨砩L(zhǎng)發(fā)育性能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的生長(zhǎng)發(fā)育情況與非轉(zhuǎn)基因奶山羊無(wú)顯著差

13、異(P＞0.05);通過(guò)對(duì)F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊血常規(guī)指標(biāo)、血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行定期檢測(cè)，研究外源基因?qū)ι窖蛏淼挠绊?。結(jié)果表明，F(xiàn)0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)并且與非轉(zhuǎn)基因奶山羊無(wú)差別（P＞0.05）。而在F0代奶山羊配種后至妊娠后期，轉(zhuǎn)GH基因奶山羊乳圍、乳寬及乳頭間距等極顯著大于非轉(zhuǎn)基因奶山羊(P＜0.01)。泌乳初期，轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的產(chǎn)奶量顯著高于非轉(zhuǎn)基因奶山羊(P＜0.05);而乳成分分析表明，轉(zhuǎn)G

14、H基因奶山羊羊奶的乳成分和非轉(zhuǎn)基因奶山羊羊奶無(wú)顯著差異(P＞0.05)。表明轉(zhuǎn)GH基因奶山羊在增加奶產(chǎn)量的同時(shí)，并沒有改變羊奶中各乳成分所占的比例。Western-blot檢測(cè)表明GH在奶中高表達(dá)，說(shuō)明構(gòu)建的載體能夠在乳腺中表達(dá)GH蛋白;將F0代轉(zhuǎn)GH基因奶山羊的羊奶飼喂羔羊，檢測(cè)小羊的生長(zhǎng)發(fā)育及生理生化指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小羊的生長(zhǎng)發(fā)育及生理并未受到不良影響（P＞0.05）。本研究初步獲得了泌乳初期產(chǎn)奶量顯著增加的轉(zhuǎn)GH基因奶山羊，并對(duì)F0