轉(zhuǎn)GFP基因體細(xì)胞核移植克隆牛胚胎的研究.pdf

1、本文對提高轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植克隆牛早期胚胎發(fā)育進(jìn)行了研究，目的是為了優(yōu)化體細(xì)胞核移植法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆牛胚胎，以克服重構(gòu)胚胎發(fā)育阻斷，為提高體外克隆轉(zhuǎn)基因胚胎的質(zhì)量和數(shù)量提供理論基礎(chǔ)。本論文設(shè)計了五個試驗(yàn)，分別為：試驗(yàn)一探討了HYA(透明質(zhì)酸酶)的濃度和作用時間對牛體外成熟卵母細(xì)胞脫卵丘及電激活參數(shù)對牛孤雌胚胎的影響；試驗(yàn)二試驗(yàn)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法與電穿孔法，以攜帶綠色熒光蛋白(GFP)-新霉素抗性(neo-)雙標(biāo)記基因的PMSCV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胎

2、牛耳成纖維細(xì)胞為供體與體外成熟的牛卵母細(xì)胞為受體構(gòu)建克隆胚，研究不同轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建供體細(xì)胞對重構(gòu)胚發(fā)育的影響，并研究供體細(xì)胞的傳代次數(shù)對轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚的影響；試驗(yàn)三卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的EGF對轉(zhuǎn)基因核移植胚胎的發(fā)育影響；試驗(yàn)四不同強(qiáng)度的電脈沖+乙醇+6-DMAP對牛轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚的融合和激活，電融合液中鈣離子濃度對融合效果的影響；實(shí)驗(yàn)五利用以上優(yōu)化方案生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎，研究轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚在不同體外發(fā)育培養(yǎng)系統(tǒng)與培養(yǎng)體系中的發(fā)育效

3、果。 試驗(yàn)結(jié)果如下：1.體外成熟培養(yǎng)液中添加EGF30ng/mL組卵母細(xì)胞成熟率最高，對轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率，以添加EGF20ng/mL組最高。2.不同轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞構(gòu)建重構(gòu)胚，其囊胚發(fā)育率差異不顯著(P>0.05)，但脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法效果較好。3.傳代5次的胎牛耳成纖維細(xì)胞做核供體，較有利于轉(zhuǎn)基因胚的發(fā)育。4.卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)22h，用0.20％HYA作用10min與0.50％HYA作用5min脫卵丘差異不顯著(P>0.