體細胞核移植山羊遺傳鑒定及核移植山羊和牛全基因組DNA甲基化研究.pdf

1、體細胞核移植動物的生產(chǎn)，在基礎理論研究和應用研究方面，如農(nóng)業(yè)、遺傳資源的保護和人類醫(yī)學等，均具有廣闊的應用前景。微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA)隨機、廣泛地分布于真核生物基因組中，具有多態(tài)性豐富、共顯性和可使用PCR方法進行方便地檢測等優(yōu)點，是親子鑒定和個體身份鑒定的首選分子標記。鑒于此，微衛(wèi)星技術也經(jīng)常用來對體細胞核移植個體進行遺傳鑒定。DNA甲基化是體細胞核移植克隆中體細胞核“表觀遺傳重編程”的一個重要方面。大量研

2、究表明DNA甲基化重編程在附植前的克隆胚胎中發(fā)生了異常，且研究發(fā)現(xiàn)附植后克隆胎兒的甲基化與人工授精胎兒相比也呈現(xiàn)出顯著變異，這些可能與克隆效率低下和克隆動物多發(fā)的各種機體缺陷有關。因此，從基因組水平對克隆動物DNA甲基化進行研究，有助于了解體細胞核移植動物發(fā)育異常和表觀遺傳修飾的關系，也可為體細胞克隆技術的改進提供參考。 本研究包括兩部分內(nèi)容： 第一部分：以2個已知無親緣關系的魯北白山羊個體，對36個微衛(wèi)星位點進行擴增和

3、聚丙烯酰胺凝膠分析，篩選出了10個多態(tài)性高的位點用于3只體細胞核移植山羊與其供核細胞遺傳同一性的鑒定及與其受體母羊間母子關系的排除。結果發(fā)現(xiàn)分別在9(C1)、10(C2)和9個(F)位點上克隆山羊的基因型與受體母羊的不同而與供體核細胞的相同，證實了克隆山羊是由體細胞克隆而來。 第二部分：首次采用MSAP的方法，以自然繁殖個體為對照，在基因組水平上分別對3只體細胞核移植山羊和3頭體細胞核移植牛進行DNA甲基化分析，并在體細胞核移植

4、山羊和核移植牛個體中分別找到28處和10處差異的甲基化位點并測序。 所測得的28個克隆山羊的差異序列與牛數(shù)據(jù)庫中的序列具有很高的同源性，其中有15個序列與牛數(shù)據(jù)庫中序列的同源性達92％以上，覆蓋差異序列的長度幾乎達100％；大部分差異序列主要與牛數(shù)據(jù)庫中一些GNOMON預測的結構基因的內(nèi)含子具有很高的同源性。所測得的10個克隆牛的差異序列有7個與牛數(shù)據(jù)庫中序列的同源性在97％～100％之間，覆蓋差異序列的長度也幾乎達100％，有

5、4個差異序列屬間隔DNA或無特征的基因組序列，另外一些差異序列為GNOMON預測的結構基因內(nèi)含子的一部分。將所得序列與所有物種的基因組進行比對時發(fā)現(xiàn)，差異序列主要與一些散布序列具有很高的同源性，同源序列長度在20bp以上，同源性80％～100％不等。 基于牛基因組數(shù)據(jù)庫，對克隆牛10個差異甲基化位點分別進行HpaⅡ敏感PCR分析驗證(7個位點)和BSP分析驗證(3個位點)，最終證明克隆個體在其中5個位點(C1、C2、C9、C11