小鼠體細(xì)胞核移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、該項(xiàng)研究擬利用"Dolly"的克隆技術(shù)路線,即是采取體細(xì)胞的電融合技術(shù),以昆明小鼠為主要的實(shí)驗(yàn)材料,進(jìn)行小鼠體細(xì)胞克隆(核移植)的初步研究,以摸索一些哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆的共同經(jīng)驗(yàn),為人類的治療性克隆作一些鋪墊性的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的高技術(shù)探索性研究.研究方法1.為尋求一種體外穩(wěn)定培養(yǎng)早期胚胎的方法.比較了M16(用作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)基)、G1(人的8細(xì)胞胚胎的培養(yǎng)基)、CZB(一種囊胚培養(yǎng)基)從受精卵到囊胚的培養(yǎng)效果,并對CZB做了加糖

2、與不加糖、加BSA(牛血清白蛋白)與15％FBS(胎牛血清)的比較研究.此外對體外形成的囊胚做細(xì)胞記數(shù)以評估胚胎的質(zhì)量.2.尋找用電激活方法作小鼠體細(xì)胞克隆的適宜卵齡的卵母細(xì)胞及電激活參數(shù).探討SrC1<,2>(氯化鍶)激活的可行性.在0.6kv/cm、80μs、2p電脈沖下,比較HCG后13、16、19、22h卵母細(xì)胞的激活率、碎裂+死亡率.在上述相同電脈沖下,比較經(jīng)體外培養(yǎng)(IVC)和新鮮的卵齡為16、19、22h的卵母細(xì)胞的激活率

3、,碎裂+死亡率.比較場強(qiáng)分別為0.6、0.9、1.2、1.5、1.8kv/cm,電壓時(shí)程分別為10、20、40、80、100、150、200μs,兩個(gè)脈沖對HCG后16h卵母細(xì)胞的電激活效果.研究SrCl<,2>在5、10、15、20 mmol/l的高濃度下,作用3、6、9h的激活及在1、1.5、2.0、3.0mmol/l低濃度下作用10min、6h的激活效果.3.為探討2-c期受精卵電融合的適宜的參數(shù),交流電場及電融合液對融合效果的影

4、響.取正常2-c期的受精卵,觀察在融合液中作用后清洗8次、不清洗的發(fā)育情況.融合脈沖前后給予20s的直流脈沖80v/cm 2MHz、600v/cm 2MHz,觀察其對融合效果的影響.觀察不同電壓強(qiáng)度與電壓時(shí)程配合下的融合效果.4.比較了表面張力法STA(Surface Tension Assisted)、A(透明帶切口+粗去核管去核)、B(細(xì)去核管一步法去核)三種方法的去核效果.分別以0.6kv/cm、100μs、2p,1.2kv/cm