山羊體細(xì)胞核移植的研究.pdf

1、為了優(yōu)化山羊體細(xì)胞核移植體系,該論文研究了體細(xì)胞核移植操作過(guò)程中的幾個(gè)影響因素:(1)體外培養(yǎng)體系對(duì)山羊胚胎早期發(fā)育的影響;(2)胞質(zhì)去除及CB處理對(duì)山羊孤雌胚和核移植胚早期發(fā)育的影響;(3)供體細(xì)胞類型、重組胚構(gòu)建方法及細(xì)胞冷凍對(duì)山羊體細(xì)胞核移植胚早期發(fā)育的影響.1.在SOFaa、CR1aa、mCR1aa三種培養(yǎng)液中添加不同濃度的成年山羊血清(NGS),觀察其對(duì)山羊孤雌胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)的效果.結(jié)果表明,山羊孤雌胚胎在這三種培養(yǎng)液中,以

2、添加10%的NGS對(duì)早期發(fā)育效果較好,囊胚率分別可達(dá)62.79%,53.52%,13.64%;mCR1aa組囊胚發(fā)育率和囊胚細(xì)胞數(shù)顯著低于SOFaa組和CR1aa組,SOFaa組和CR1aa組間無(wú)顯著差異,SOFaa組優(yōu)于CR1aa組.2.將MⅡ期的卵母細(xì)胞用CB處理(試驗(yàn)組Ⅰ)或去除部分細(xì)胞質(zhì)不去核(試驗(yàn)組Ⅱ)或在CB處理后再去除部分胞質(zhì)不去核(試驗(yàn)組Ⅲ),以及不做任何處理(對(duì)照組),經(jīng)孤雌激活和體外培養(yǎng)觀察發(fā)育情況.結(jié)果:試驗(yàn)組Ⅰ、

3、Ⅱ、Ⅲ以及對(duì)照組均獲得了較高的囊胚期發(fā)育率(依次為55.50%、37.43%、39.78%、59.82%),及較高的卵裂率(分別為72.35%、71.55%、64.87%、86.15%),但試驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ的分裂球不均勻的卵裂率明顯高于試驗(yàn)組Ⅲ與對(duì)照組.3.以乳腺細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞和顆粒細(xì)胞作為供體進(jìn)行核移植,對(duì)比細(xì)胞冷凍及核移植的重建方法(胞質(zhì)內(nèi)注射、電融合)對(duì)重組胚早期發(fā)育的影響.結(jié)果:(1)乳腺細(xì)胞支持重組胚的發(fā)育能力(囊胚率,7.

4、14%)顯著低于成纖維細(xì)胞(16.19%)和顆粒細(xì)胞(19.01%)(P<0.05),卵裂率無(wú)顯著差異(P>0.05);(2)三種供體細(xì)胞在冷凍-解凍后支持重組胚發(fā)育力方面無(wú)顯著差異(P>0.05);(3)乳腺上皮細(xì)胞構(gòu)建重組胚的效率電融合組(69.52%)極顯著高于胞質(zhì)注射組(59.20%)(P<0.01),囊胚發(fā)育率無(wú)顯著差異(P>0.05);成纖維細(xì)胞的重組成功率、卵裂率和囊胚率在兩組間均無(wú)顯著差異(P>0.05);顆粒細(xì)胞重組成

5、功率胞質(zhì)內(nèi)注射組(82.17%)顯著高于電融合組(50.99%)(P<0.05),囊胚發(fā)育率無(wú)顯著差異(P>0.05),胞質(zhì)內(nèi)注射組稍高于電融組.結(jié)論:(1)在該實(shí)驗(yàn)條件下,山羊孤雌胚胎的體外培養(yǎng)以SOFaa為培養(yǎng)液,在培養(yǎng)的第72h時(shí)加入10%的NGS的發(fā)育效果較好,囊胚率可達(dá)62.79%.(2)CB處理對(duì)孤雌胚發(fā)育無(wú)影響;胞質(zhì)去除1/3以內(nèi)對(duì)孤雌胚的發(fā)育影響不大;CB處理與胞質(zhì)聯(lián)合對(duì)山羊孤雌胚早期發(fā)育起協(xié)調(diào)作用,提高卵母細(xì)胞孤雌胚發(fā)