利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊的研究.pdf

1、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因是目前生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,其基本特征是改變了動(dòng)物的遺傳組成,使動(dòng)物按照人們的意愿進(jìn)行改造.以傳統(tǒng)的原核顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率非常低下(成功率僅為3~5﹪),嚴(yán)重地制約了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究進(jìn)展.與之相比,體細(xì)胞克隆技術(shù)在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方面有著不可比擬的優(yōu)越性.利用體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)是:轉(zhuǎn)基因操作主要是集中在細(xì)胞水平上完成,從而極大地提高了生產(chǎn)效率、降低了生產(chǎn)成本和減少了工作強(qiáng)度;在體外可以監(jiān)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)

2、水平,以便獲得高效表達(dá)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物;對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾,促進(jìn)生物醫(yī)藥、功能基因組等方面的研究.該實(shí)驗(yàn)以Myostatin基因?yàn)榘谢?、含有新霉素抗性基因、綠色熒光蛋白基因、胸苷激酶、LoxP位點(diǎn)的雙標(biāo)記選擇載體作為框架結(jié)構(gòu)、羊胎兒成纖維細(xì)胞和成年耳部成纖維細(xì)胞系為轉(zhuǎn)染細(xì)胞,測(cè)定了不同轉(zhuǎn)染方法(磷酸鈣法,脂質(zhì)體法及電擊法)的轉(zhuǎn)染效果,篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆,借助體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎.建立了一套完整的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)制備、體細(xì)胞的傳代培養(yǎng)、體

3、細(xì)胞性別鑒定、轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系建立、轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的生產(chǎn)等操作程序,為羊轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆提供了行之有效的實(shí)驗(yàn)方法.通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明,構(gòu)建的ploxP-M雙標(biāo)記同源重組轉(zhuǎn)基因載體可以很好地實(shí)現(xiàn)基因敲除目的.磷酸鈣法、:脂質(zhì)體法及電擊法可有效地轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞,但以電擊法效果為最佳,該轉(zhuǎn)染方法還具有適合于不同片段大小、操作簡(jiǎn)便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn).在隨機(jī)整合細(xì)胞系中由于插入位點(diǎn)和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的不同造成了熒光蛋白表達(dá)水平的差異,但更重要的是