絨山羊轉(zhuǎn)胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ基因體細(xì)胞核移植胚胎的制備.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)自上世紀(jì)八十年代確立以來(lái),在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)以及基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng)域都有十分廣泛的研究和應(yīng)用,也取得了令人矚目的成績(jī)。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中,這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用方興未艾。在改良動(dòng)物遺傳性狀以提高生產(chǎn)性能、加強(qiáng)畜禽抗病育種以及通過乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白等非常規(guī)畜牧生產(chǎn)方面,轉(zhuǎn)基因技術(shù)正顯示出廣闊的應(yīng)用前景。但是,只有當(dāng)體細(xì)胞核移植技術(shù)真正確立以后,轉(zhuǎn)基因家畜的研究和制備效率才得以大幅提高。利用轉(zhuǎn)染了外源基因的體細(xì)胞通過核移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)

2、物是目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的主要技術(shù)路線。本研究即采用了這種轉(zhuǎn)基因方法,以毛囊特異表達(dá)的啟動(dòng)子pKAP6-1、pUHS分別引導(dǎo)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF1)基因,以新霉素抗性基因和紅色熒光蛋白基因作為雙選擇標(biāo)記,首次構(gòu)建成功2個(gè)毛囊細(xì)胞中特異性表達(dá)IG目的表達(dá)載體；利用體外轉(zhuǎn)染技術(shù)將此2個(gè)表達(dá)載體分別導(dǎo)入絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞,通過G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的2種克隆細(xì)胞；以體細(xì)胞核移植技術(shù)制備絨山羊轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。本研究為轉(zhuǎn)基因絨山羊

3、的培育,以及探討IGF1在絨山羊毛囊發(fā)育和生長(zhǎng)周期中的調(diào)控作用提供了研究基礎(chǔ)。 1.IGF1毛囊細(xì)胞特異性表達(dá)載體的構(gòu)建通過PCR和RT-PCR方法從綿羊總DNA和總RNA中分別擴(kuò)增出角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白6-1基因(KAP6-1)啟動(dòng)子區(qū)序列和綿羊胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF1)編碼區(qū)cDNA序列,以pMD19T為克隆骨架構(gòu)建成中間克隆載體p19TKI。將CMV啟動(dòng)子序列連接在pDsRed2-1表達(dá)框架的紅色熒光蛋白報(bào)告基因(Red2)上

4、游Kpn I+Sma I位點(diǎn)構(gòu)成pCDsRed2;pCDsRed2經(jīng)EcoR I酶切,與p19TKI的KI片段連接構(gòu)成IGF1毛囊細(xì)胞特異表達(dá)的第一種載體pCDsR-KI。以PCR方法從小鼠基因組DNA擴(kuò)增出超高硫角蛋白基因(UHS)啟動(dòng)子區(qū)序列,與pMD19T、IGF1 cDNA(SalI+SphI酶切片段)構(gòu)建成中間克隆載體p19TUI;pCDsRed2經(jīng)Sac I+EcoR I酶切、Klenow Fragment補(bǔ)平EcoR I端

5、,與p19TUI的UI片段(經(jīng)過Sac I+Sph I酶切、Klenow Fragment補(bǔ)平Sph I端)連接構(gòu)成毛囊細(xì)胞特異表達(dá)的第二種載體pCDsR-UI限制性內(nèi)切酶分析和部分序列測(cè)定結(jié)果表明,本研究所構(gòu)建的兩個(gè)表達(dá)載體pCDsR-KI和pCDsR-UI,其結(jié)構(gòu)與序列均與預(yù)期設(shè)計(jì)完全符合。 2.絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞以組織塊貼附方法進(jìn)行分離,在DMEM/F12+10％FBS培養(yǎng)液,37℃、

6、5％CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。原代成纖維細(xì)胞以DMEM/F 12+20％FBS+DMSO培養(yǎng)液冷凍保存。在顯微鏡下觀察和記錄了絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)特性,繪制出第1、2和6代胎兒成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,通過制作第2、第6代細(xì)胞中期染色體標(biāo)本,分析核型特征。經(jīng)以上分析證明,我們分離和培養(yǎng)的絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下,其生長(zhǎng)力旺盛,1、2、6代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的各個(gè)時(shí)期特征基本保持一致,隨代次增加,生長(zhǎng)速度漸緩；第2

7、、6代細(xì)胞的染色體數(shù)目正常(2n=60),染色體正常比率分別為82.0％和77.6％。 3.絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的外源基因轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000與線性化表達(dá)載體pCDsR-KI混合(轉(zhuǎn)基因A組)、脂質(zhì)體LipofectamineTM Reagent與線性化表達(dá)載體pCDsR-UI混合(轉(zhuǎn)基因B組)后,分別轉(zhuǎn)染至第2代絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞。并對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行了優(yōu)化,探明了脂質(zhì)體和DNA的最佳組合條件及轉(zhuǎn)染時(shí)間。以

8、800μg/ml G418作為抗性篩選的濃度,在DMEM/F12+10％FBS培養(yǎng)液、37℃、5％CO2、飽和濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)12～15天,分別獲得了兩組表達(dá)紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因克隆細(xì)胞,其中A轉(zhuǎn)染組共有23個(gè)陽(yáng)性克隆、B轉(zhuǎn)染組有11個(gè)陽(yáng)性克隆。經(jīng)過比較轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線和染色體核型分析證實(shí),轉(zhuǎn)基因和體外篩選過程并沒有導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和染色體核型的異常。通過對(duì)兩組轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組DNA特異性區(qū)域的PCR擴(kuò)增,證實(shí)外源基因IG

9、F1及其表達(dá)控件已穩(wěn)定整合在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組中。 4.絨山羊轉(zhuǎn)基因胎兒成纖維細(xì)胞的核移植在非繁殖季節(jié),從136個(gè)絨山羊卵巢采集到卵母細(xì)胞復(fù)合體738枚；在繁殖季節(jié),從384個(gè)卵巢共采集卵母細(xì)胞復(fù)合體1915枚。經(jīng)體外成熟培養(yǎng),非繁殖季節(jié)的卵母細(xì)胞成熟率為73.4％(542/738),略高于繁殖季節(jié)的成熟率65.5％(1254/1915);體外成熟培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)定為18、20和24hr進(jìn)行分組培養(yǎng),其中20hr組成熟率80.6％(

10、79/98)、24hr組成熟率82.2％(83/101)均顯著高于18hr組成熟率67.1％(51/76),P<0.05。以7％乙醇7 min+2mM 6-DMAP 4 hr和5μMIA23187 5min+2mM 6-DMAP 4hr兩種激活方法處理成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活,48hr后統(tǒng)計(jì)卵裂率為86.4％和88.7％,二者之間差異不顯著(P>0.05)。選擇IA23187激活方法用于重構(gòu)胚的激活。分別設(shè)定三種不同強(qiáng)度的融合條件(13

11、0V/mm、190V/mm和200V/mm)進(jìn)行電融合率,融合率分別為32.8％、62.4％和42.9％。分別以轉(zhuǎn)染有pCDsR-KI的A組成纖維細(xì)胞和轉(zhuǎn)有pCDsR-UI的B組細(xì)胞作為核供體,以去核成熟卵母細(xì)胞作為胞質(zhì)受體制備轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。以SOFaa+BSA培養(yǎng)液培養(yǎng)48hr,統(tǒng)計(jì)卵裂率,結(jié)果A組為79.3％(161/203),B組為62.5％(40/64)。經(jīng)過SOFaa+4％FBS體外培養(yǎng)7～9天,A組轉(zhuǎn)基因得到囊胚數(shù)為31枚