小鼠-豬促間體細(xì)胞核移植研究.pdf

1、隨著體細(xì)胞核移植(SCNT)研究的深入,種間體細(xì)胞核移植(iSCNT)開始受到越來越多的重視,并不斷取得進(jìn)展。大量研究發(fā)現(xiàn),核供體細(xì)胞重編程不完全或者錯(cuò)誤,可能是導(dǎo)致核移植失敗的主要原因。種間體細(xì)胞核移植是研究核重編程分子機(jī)制、細(xì)胞核質(zhì)互作關(guān)系和早期胚胎發(fā)育的重要模型；種間體細(xì)胞核移植研究也有助于瀕危野生動(dòng)物的保護(hù),在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究借助顯微操作技術(shù),以小鼠體細(xì)胞作為核供體細(xì)胞、豬體外成熟卵母細(xì)胞為核受體細(xì)胞

2、,進(jìn)行小鼠-豬種間體細(xì)胞核移植操作,所獲種間克隆胚胎置于5％CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。旨在研究核供體細(xì)胞所需條件和受體卵母細(xì)胞所需條件對小鼠-豬種間克隆胚胎發(fā)育的影響,探索影響種間核移植操作的主要相關(guān)因素,以期建立種間克隆胚胎體外生產(chǎn)模型,為進(jìn)一步研究核重編程及核質(zhì)互作機(jī)理奠定基礎(chǔ)。M16是常用的小鼠胚胎培養(yǎng)液,37℃是小鼠胚胎常用的培養(yǎng)溫度；而豬胚胎常用的培養(yǎng)液和培養(yǎng)溫度分別是NCSU-23和38.5℃。將小鼠-豬種間克隆

3、胚胎分別在37℃、38.5℃條件下,又分別培養(yǎng)于M16和NCSU-23培養(yǎng)液中,研究供體還是受體所需培養(yǎng)條件對種間克隆胚胎發(fā)育的影響更大。根據(jù)上述結(jié)果,將獲得的小鼠-豬種間克隆胚胎在優(yōu)化條件下進(jìn)行體外培養(yǎng),進(jìn)一步研究種間核移植的影響因素,包括核供體細(xì)胞來源、核供體細(xì)胞傳代次數(shù)、操作液中添加細(xì)胞松弛素B處理及卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)間等。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.選擇不同生理狀態(tài)的小鼠進(jìn)行超數(shù)排卵,分為陰門粉紅色組和白色組,比較2組

4、小鼠超數(shù)排卵成功率,結(jié)果顯示陰門粉紅小鼠的超排成功率為81.25％,高于陰門發(fā)白小鼠組(60.0％)。
　　 2.將2-細(xì)胞期小鼠-豬種間克隆胚胎、小鼠自然體內(nèi)胚胎置于37℃、M16培養(yǎng)液中培養(yǎng),研究種問克隆胚胎對于供體或受體細(xì)胞培養(yǎng)液的適應(yīng)性。于培養(yǎng)1、2和7 d觀察2組胚胎在小鼠胚胎常規(guī)培養(yǎng)條件下的發(fā)育情況。結(jié)果顯示種間克隆胚胎的發(fā)育能力明顯低于小鼠自然體內(nèi)胚胎,16-細(xì)胞與囊胚發(fā)育率分別為15.1％對80.9％和0.0％對

5、27.7％。
　　 3.將小鼠-豬種間克隆胚胎、豬體外受精(IVF)胚胎置于38.5℃、NCSU-23培養(yǎng)液中培養(yǎng),研究種間克隆胚胎對于供體或受體細(xì)胞培養(yǎng)液的適應(yīng)性。于培養(yǎng)1、2和7 d觀察2組胚胎在豬胚胎常規(guī)培養(yǎng)條件下的發(fā)育情況.結(jié)果顯示種間克隆胚胎的發(fā)育能力要明顯低于豬IVF胚胎；iSCNT胚胎的16-細(xì)胞和囊胚發(fā)育率(9.6％和0.0％),均顯著低于IVF胚胎16-細(xì)胞和囊胚發(fā)育率(30.6％和17.3%)。
　　

6、 4.選擇NCSU-23作為小鼠-豬種間克隆胚胎培養(yǎng)基,分別置于38.5℃和37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于培養(yǎng)1、2和7 d觀察不同溫度對iSCNT胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明,兩組卵裂率雖無顯著差異,但iSCNT胚胎在38.5℃條件下的發(fā)育能力優(yōu)于37℃組;8-細(xì)胞和16-細(xì)胞發(fā)育率分別為59％對29.7％和13.1％對4.7％,證明38.5℃是更適合小鼠-豬種間克隆胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)溫度。
　　 5.選擇38.5℃作為小鼠-豬i

7、SCNT胚胎的培養(yǎng)溫度,分別置于NCSU-23、M16兩種培養(yǎng)液中培養(yǎng),于1、2和7 d觀察不同培養(yǎng)液對iSCNT胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果顯示小鼠-豬iSCNT胚胎在NCSU-23培養(yǎng)液的發(fā)育能力高于M16培養(yǎng)液組；卵裂率與16-細(xì)胞發(fā)育率分別為71.2％對51.1％和10.9％對5.3％,表明NCSU-23培養(yǎng)液更適合小鼠-豬iSCNT胚胎的發(fā)育。
　　 6.分別用小鼠胎兒成纖維細(xì)胞、小鼠卵丘細(xì)胞及不同傳代次數(shù)的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞

8、作為核供體細(xì)胞,將獲得的iSCNT胚胎培養(yǎng)于38.5℃、NCSU-23培養(yǎng)液中,于培養(yǎng)1、2和7 d觀察克隆胚胎的發(fā)育情況。結(jié)果顯示不同核供體細(xì)胞來源和2～4代的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞來源的小鼠-豬種間克隆胚胎發(fā)育無明顯差異。
　　 7.在操作液中添加細(xì)胞松弛素B(CB),比較CB處理卵母細(xì)胞或不處理對照組所獲小鼠-豬iSCNT胚胎的發(fā)育情況。結(jié)果表明,添加或不添加CB處理,所獲種間克隆胚卵裂率和16-細(xì)胞發(fā)育率無顯著差異。