利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是目前生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，其通過(guò)改變了動(dòng)物的遺傳組成，使動(dòng)物按照人們的意愿進(jìn)行改造。以傳統(tǒng)的原核顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率非常低下(成功率僅為3～5％)，嚴(yán)重地制約了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究進(jìn)展。與之相比，體細(xì)胞克隆技術(shù)在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方面有著不可比擬的優(yōu)越性，成為目前生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜的最佳方法。綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因豬研究可以為家豬育種、人類疾病模型和人類異種器官移植研究奠定良好的基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)研究了質(zhì)粒濃度，脂質(zhì)

2、體濃度，脂質(zhì)體．質(zhì)粒復(fù)合物與細(xì)胞共孵育時(shí)間對(duì)GFP轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞效率的影響，通過(guò)(3418的篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白基因的陽(yáng)性細(xì)胞，并以此陽(yáng)性細(xì)胞作為體細(xì)胞核移植的核供體，以體外成熟卵母細(xì)胞為核受體構(gòu)建了綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因克隆豬胚胎，并對(duì)重構(gòu)胚在體外和體內(nèi)發(fā)育情況以及綠色熒光蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了跟蹤研究。取得如下結(jié)果： 1．G418篩選濃度為500μg/ml，維持篩選濃度為200μg/ml，在篩選到30天左右時(shí)，可以獲

3、得較純的、能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的豬胎兒成纖維細(xì)胞： 2．原代至3代的PFF，24孔培養(yǎng)板70～90％匯合程度，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(lipofeet transfection regent)為2.0μl、質(zhì)粒(pEGFP-C1)0.8μg，復(fù)合物作用時(shí)間為6h時(shí)獲得的轉(zhuǎn)染效率最高，轉(zhuǎn)染效率約3.78％； 3．GFP轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞重構(gòu)胚體外囊胚發(fā)育率為11.4％，GFP陽(yáng)性胚胎率為55.2％； 4．重構(gòu)胚移植于10頭

4、受體后，有5頭妊娠，3頭受體發(fā)育到期，共產(chǎn)出克隆豬6頭，其中4頭為GFP陽(yáng)性，經(jīng)DNA檢測(cè)確認(rèn)為GFP轉(zhuǎn)基因豬；轉(zhuǎn)基因克隆胚胎移植出生率為1.0％，陽(yáng)性個(gè)體出生率為0.7％。 結(jié)果表明脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑可以高效轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，獲得的陽(yáng)性細(xì)胞具有支持豬全程發(fā)育的潛能。通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆豬，建立了一套較完善的體細(xì)胞傳代培養(yǎng)、體細(xì)胞轉(zhuǎn)染、陽(yáng)性細(xì)胞篩選和傳代、轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的生產(chǎn)和移植的生產(chǎn)體系，為今后在豬基因組上進(jìn)行