小鼠睪丸支持細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的:胚胎干細(xì)胞(ESC)具有全能性，能夠分化成一個(gè)完整生命個(gè)體所需之各式各樣的不同的細(xì)胞。ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化是目前國(guó)際上研究的熱點(diǎn)，其中ES細(xì)胞向生殖細(xì)胞的分化是一個(gè)非常新的領(lǐng)域。近年來(lái)，在移植研究中用原始生殖細(xì)胞(PGC)和生殖干細(xì)胞(GSC)來(lái)改善生育已經(jīng)取得了不同程度的成功，這使研究者們把研究深度進(jìn)一步加深，用ES細(xì)胞作為生殖細(xì)胞分化的起始點(diǎn)。到目前為止，共有五個(gè)實(shí)驗(yàn)室分化成功。這五個(gè)實(shí)驗(yàn)室都是先將胚胎干細(xì)胞分化成類(lèi)

2、胚體(EB)，EBs包含早期胚胎典型的組織系統(tǒng)，再加一些誘導(dǎo)劑或條件培養(yǎng)基或者只是讓細(xì)胞自發(fā)分化，一段時(shí)間之后可以檢測(cè)到生殖細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)。本研究是將小鼠睪丸支持細(xì)胞與ES細(xì)胞共培養(yǎng)，支持細(xì)胞與ES細(xì)胞形成細(xì)胞間接觸，同時(shí)支持細(xì)胞還可以分泌一些細(xì)胞因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-4)，在這兩種因素的作用下，誘導(dǎo)ES細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化，目的在于用模擬體內(nèi)的微環(huán)境來(lái)誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成生殖細(xì)胞。我們將小鼠睪丸支持細(xì)胞與ES細(xì)胞共培養(yǎng)，在一定

3、的時(shí)間點(diǎn)用RT-PCR，原位雜交，免疫組化和Western-Blotting檢測(cè)生殖細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)；其中鼠vasa同源體(Mvh)的表達(dá)有力證實(shí)了小鼠ES細(xì)胞分化成生殖細(xì)胞。通過(guò)該研究，我們用模擬體內(nèi)的微環(huán)境誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成生殖細(xì)胞，建立一種相對(duì)穩(wěn)定的體外分化系統(tǒng)，有助于分析生殖細(xì)胞分化過(guò)程中的基因演變和外遺傳的程序重調(diào)，有助于核轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展和不育治療。 第一部分小鼠睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 方法：取18～2

4、0天雄性ICR小鼠的睪丸，酶消化法原代培養(yǎng)。用RT-PCR的方法克隆帶有鋅指結(jié)構(gòu)域的支持細(xì)胞基因(SERZ)，與pcDNA3.0連接后構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.0-SERZ。用KpnⅠ和XbaⅠ分別酶切質(zhì)粒pcDNA3.0-SERZ，獲得線(xiàn)性化模板進(jìn)而合成探針。原位雜交檢測(cè)SERZmRNA在培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)；用RT-PCR的方法檢測(cè)雄激素結(jié)合蛋白(ABP)在支持細(xì)胞中的表達(dá)。另外，支持細(xì)胞在電鏡下有特征性結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電鏡拍照觀察。

5、結(jié)果：光鏡下，支持細(xì)胞多為多邊形，細(xì)胞完全鋪開(kāi)，成膜狀，相鄰細(xì)胞之間交織連接。電鏡下，支持細(xì)胞的核呈三角形或不規(guī)則形，染色淺，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器比較豐富，糖原、脂滴、溶酶體和線(xiàn)粒體較多，相鄰細(xì)胞之間形成緊密連接。原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示SERZmRNA在培養(yǎng)細(xì)胞的胞漿中高水平表達(dá)。RT-PCR結(jié)果表明我們分離的支持細(xì)胞能夠表達(dá)ABPmRNA。結(jié)論：我們成功分離和鑒定了小鼠睪丸支持細(xì)胞，純度在85％以上，為以下的實(shí)驗(yàn)提供了準(zhǔn)確、有效的實(shí)驗(yàn)

6、工具。 第二部分小鼠睪丸支持細(xì)胞對(duì)小鼠ES細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化 方法：將小鼠睪丸支持細(xì)胞與小鼠ES細(xì)胞共培養(yǎng)(共培養(yǎng)組)，同時(shí)設(shè)ES細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組(自發(fā)分化組)和小鼠睪丸支持細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)組(條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)組)作為對(duì)照。3d和7d后分別收集細(xì)胞，做流式分選(FACS)，利用ES細(xì)胞帶有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記從而發(fā)綠色熒光的特性將ES細(xì)胞與小鼠睪丸支持細(xì)胞分開(kāi)。分選完后，一部分細(xì)胞抽提總RNA，利用特異的引物檢測(cè)Mv

7、h，DAZL，Mil-2，Oct-4和c-Kit這些細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參照；一部分細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，Western-Blotting檢測(cè)SSEA-1的表達(dá)水平；一部分細(xì)胞做成細(xì)胞涂片，免疫組化檢測(cè)SSEA-1的表達(dá)，原位雜交檢測(cè)Mvh的表達(dá)。結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)到三天共培養(yǎng)組中生殖細(xì)胞的標(biāo)志物Mvh，DAZL，Mil-2，Oct-4和c-Kit的表達(dá)，七天共培養(yǎng)組中Mvh，DAZL，M

8、il-2和c-Kit的表達(dá)略有增加，Oct-4的表達(dá)略有下降。同時(shí)RT-PCR也分別檢測(cè)到三天條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)組和自發(fā)分化組中生殖細(xì)胞的標(biāo)志物Mvh，DAZL，Mil-2，Oct-4和c-Kit的表達(dá)，七天條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)組和自發(fā)分化組中Mvh，DAZL，Mil-2和c-Kit的表達(dá)分別略有增加，Oct-4的表達(dá)分別略有下降。同時(shí)間段的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，共培養(yǎng)組中生殖細(xì)胞的標(biāo)志物Mvh，DAZL，Mil-2和c-Kit的表達(dá)分別比條件培

9、養(yǎng)基誘導(dǎo)組略高，而條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)組又分別比自發(fā)分化組略高；共培養(yǎng)組中Oct-4的表達(dá)比條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)組略低，而條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)組又比自發(fā)分化組略低。免疫組化染色顯示SSEA-1陽(yáng)性表達(dá)。Western-Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示三天共培養(yǎng)組中SSEA-1表達(dá)水平比對(duì)照組(ES組)低，七天共培養(yǎng)組中SSEA-1表達(dá)水平更低，提示ES細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生分化。通過(guò)原位雜交顯色，在3d共培養(yǎng)組中就可以檢測(cè)到Mvh陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，7d共培養(yǎng)組中Mvh陽(yáng)

10、性細(xì)胞增多，但是陽(yáng)性率較低，提示ES已經(jīng)向生殖細(xì)胞分化，但是分化率不高。結(jié)論：將小鼠睪丸支持細(xì)胞與ES細(xì)胞共培養(yǎng)，支持細(xì)胞與ES細(xì)胞形成細(xì)胞間接觸，同時(shí)支持細(xì)胞還可以分泌一些細(xì)胞因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-4)，在這兩種因素的作用下，誘導(dǎo)ES細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化；分化率比小鼠睪丸支持細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)組和ES細(xì)胞自發(fā)分化組略高。說(shuō)明小鼠睪丸支持細(xì)胞與ES細(xì)胞共培養(yǎng)，可以模擬體內(nèi)的微環(huán)境從而誘發(fā)ES細(xì)胞向生殖細(xì)胞方向分化。 結(jié)論1