簡(jiǎn)介：目的艱難梭菌CLOSTRIDIUMDIFFICIIE是造成抗生素相關(guān)性結(jié)腸炎及偽膜性結(jié)腸炎PMC的最常見(jiàn)致病菌。該菌造成老年人和免疫功能低下的病人抗生素相關(guān)性腹瀉及腸炎的發(fā)病率及死亡率明顯升高。CDIFFICILE產(chǎn)毒株準(zhǔn)確快速的診斷、鑒定，對(duì)確定病源、控制其傳播、有效治療患者是極其重要的。國(guó)外建立的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA檢測(cè)CDIFFICILE毒素，其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度和特異度高，結(jié)果可在24小時(shí)內(nèi)得出，從而更適合指導(dǎo)臨床實(shí)際工作，故被大力推廣，但國(guó)內(nèi)對(duì)艱難梭菌診斷試劑研究較少，尤其是對(duì)CDIFFICILE細(xì)胞毒素BCDTB的檢測(cè)。本課題利用CDTB特點(diǎn)，以基因工程技術(shù)對(duì)其羧基末端功能區(qū)進(jìn)行克隆、表達(dá)并純化出該蛋白，制備多克隆抗體，主要目的在于對(duì)該重組蛋白生物學(xué)特性進(jìn)行研究和探索，以期建立一種可快速、穩(wěn)定的檢測(cè)出CDIFFICILE細(xì)胞毒素B的ELISA診斷試劑。方法1、基因工程技術(shù)制備CDTB膜受體結(jié)合區(qū)域的重組蛋白。以CDIFFICILE標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463的全長(zhǎng)DNA序列為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼CDTB膜受體結(jié)合區(qū)域的功能基因，經(jīng)ECI和XHOI雙酶切后，定向插入同樣經(jīng)這兩種酶雙酶切的原核表達(dá)載體PET22B中，在DNAT4連接酶作用下進(jìn)行連接以獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序，結(jié)果與GENBANK記錄的CDIFFICILEVPI10463的CDTB羧基末端BP56497496基因序列相比對(duì)。將正確的重組子轉(zhuǎn)化至ECOLIBL21DE3細(xì)菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出特異性蛋白，利用SDSPAGE檢測(cè)重組蛋白。2、親和色譜法純化重組蛋白并進(jìn)行WESTERNBLOT分析。因表達(dá)載體PET22B具有HISTAG序列，故與固定化金屬離子NI2之間具有親合力，金屬螯合到固相支持物共價(jià)結(jié)合的反應(yīng)性基團(tuán)亞氨二乙酸IDA上，用咪唑?qū)⒅亟M蛋白洗脫下來(lái)，從而達(dá)到純化的目的。本研究選用NOVAGEN公司的HISTAG親合純化產(chǎn)品HISBIND樹(shù)脂和緩沖液試劑盒。純化后采用COOMASSIEBRILLIANTBLUEG250比色法，以牛血清白蛋白BSA，SIGMA為標(biāo)準(zhǔn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定重組蛋白濃度；并利用HISTAG單克隆抗體與重組蛋白進(jìn)行WESTERNBLOT分析。3、多克隆抗體制備及其生物學(xué)特性的研究。以純化重組蛋白為抗原，免疫純種雄性新西蘭大白兔，在第4次加強(qiáng)免疫后第10天，制備多抗血清，利用雙向免疫擴(kuò)散法和間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，同時(shí)檢測(cè)重組蛋白和從NOVAGEN公司購(gòu)得的CDIFFICILE細(xì)胞毒素B這兩種材料的抗原相關(guān)性。以重組蛋白與制備的多抗血清進(jìn)行WESTERNBLOT分析以檢測(cè)抗體的特異性。用自制的多克隆抗體通過(guò)間接ELISA法對(duì)5株艱難梭菌產(chǎn)毒株、2株大腸桿菌、1株雙歧桿菌進(jìn)行艱難梭菌B毒素檢測(cè)。結(jié)果1、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼CDTB膜受體結(jié)合區(qū)域的功能基因?yàn)?848BP，經(jīng)測(cè)序與相應(yīng)CDIFFICILE標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463序列區(qū)域的基因完全相同。目的基因與原核表達(dá)載體PET22B連接后獲得的重組質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果與GENBANK記錄的CDIFFICILEVPI10463的CDTB羧基末端BP56497496基因序列相比對(duì)符合率達(dá)99％。將經(jīng)鑒定的CDTBR陽(yáng)性克隆子在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)，然后進(jìn)行10％SDSPAGE電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)的重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為71300，與預(yù)期的蛋白大小一致。2、根據(jù)金屬螯合親和色譜法在非變性條件下純化重組蛋白，純化后的可溶性重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為71300，有少許降解，純度達(dá)到90％。重組蛋白純化后根據(jù)COOMASSIEBRILLIANTBLUEG250CHROMATOMETRY比色法測(cè)出的蛋白濃度為0762MGML。免疫印跡試驗(yàn)說(shuō)明重組蛋白與HISTAG單克隆抗體可以發(fā)生特異性結(jié)合3、獲得了相應(yīng)的多克隆抗血清，重組蛋白的抗原性是CDIFFICILE細(xì)胞毒素B抗原性的一部分。WESTERNBLOT分析抗艱難梭菌B毒素膜受體結(jié)合蛋白多克隆抗體可以和重組蛋白CDTBR結(jié)合，與ECOLI菌體裂解蛋白有非特異性的反應(yīng)。間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)均為110000以上。自制多克隆抗體對(duì)8株臨床細(xì)菌進(jìn)行艱難梭菌B毒素檢測(cè)顯示，3株艱難梭菌產(chǎn)毒株、1株大腸桿菌為陽(yáng)性結(jié)果，其余為陰性結(jié)果。結(jié)論L、本研究參考CDIFFICILE國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463基因序列，用自行設(shè)計(jì)的CDB3引物在PCR反應(yīng)中表現(xiàn)出較高的特異性，為理想的引物序列。蛋白電泳分析表明獲得了高效表達(dá)的CDIFFICILETOXINB3克隆株。2、本研究利用基因工程得到的重組蛋白，WESTERNBLOT證實(shí)表達(dá)的蛋白與本研究所設(shè)計(jì)相一致。為進(jìn)一步研究CDAD的診斷試劑和免疫保護(hù)作用奠定了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。3、通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)本研究發(fā)現(xiàn)，重組蛋白具有良好的免疫原性，該多克隆抗體具有良好的生物學(xué)活性、較好的特異性。但因?yàn)槭嵌嗫寺】贵w，故特異性不高，需要更深入地研究此重組蛋白，最終制備單克隆抗體，為CDIFFICILE感染的臨床診斷提供特異性的診斷試劑。

簡(jiǎn)介：山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文人白細(xì)胞介素21的基因克隆、表達(dá)及對(duì)NK92細(xì)胞生物學(xué)作用的初步研究姓名鄭瑞申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)免疫學(xué)指導(dǎo)教師王郡甫20080518山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文球蛋白IG的廣泛調(diào)解因子共同調(diào)節(jié)IGG和IGE的類(lèi)別轉(zhuǎn)換及IG的合成【121314】。IL。21和IL15協(xié)同誘導(dǎo)NAIVECD4410W和MEMORYCD44HICD8T細(xì)胞的增殖，增加產(chǎn)生IFN吖的CD8T數(shù)量，誘導(dǎo)顆粒酶B基因的表達(dá)，這表明IL21不僅能協(xié)同促進(jìn)T細(xì)胞的克隆增殖還能增強(qiáng)T細(xì)胞的功能效應(yīng)【1516】。IL一21單獨(dú)不能使NK細(xì)胞增殖或存活，甚至?xí)鯦JHNK細(xì)胞凋亡率【17】。低劑量的IL21能夠協(xié)同IL一2或IL一15促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，高劑量的IL2L卻抑制NK細(xì)胞的增殖，但這種抑制同時(shí)伴隨著向大顆粒淋巴細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生高水平的穿孔素和IFN吖，增強(qiáng)NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性【18191?？紤]至LJIL21對(duì)NK細(xì)胞功能的影響時(shí)，往往離不開(kāi)NK細(xì)胞表面受體方面的研究。NKG2D是NK細(xì)胞重要的活化性受體，曾有研究表明IL21可以通過(guò)NKG2D機(jī)制增強(qiáng)腫瘤模型鼠的抗腫瘤效應(yīng)【20】。但是也有文獻(xiàn)報(bào)道IL21通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)接頭分子DAPL0的基因表達(dá)而下調(diào)人PRIMARYNK和CD8T細(xì)胞表面NKG2D／DAPL0的表達(dá)，從而抑制PRIMARYNK細(xì)胞通過(guò)NKG2D介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用【211。這可能是由種屬差異造成的。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建含IL21基因的原核表達(dá)載體，優(yōu)化RHLL21的表達(dá)條件；探索RHIL21包涵體蛋白質(zhì)最佳復(fù)性條件；用NINTA親和層析柱純化出高純度的RHIL21，為大量生產(chǎn)RHLL21及其生物學(xué)研究或臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上以NK92細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)對(duì)NK92細(xì)胞的增殖和殺傷功能的影響以及對(duì)表面活化性受體NKG2D的表達(dá)的分析，來(lái)初步探討IL21對(duì)NK細(xì)胞的生物學(xué)作用。方法和結(jié)果1人IL21基因的克隆和分析根據(jù)GENEBANK報(bào)告的人類(lèi)IL一21基因序列，我們?cè)O(shè)計(jì)一對(duì)編碼人IL2L成熟肽的引物。上游包含NDEI酶切位點(diǎn)，下游含XHOI酶切位點(diǎn)。以本實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒PCDNA3IL21為模板，用所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出IL2L目的基因。PCR片段用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠分離純化并與TA載體PMDL8T連接，轉(zhuǎn)化到DH5A感受態(tài)細(xì)胞，平鋪于含100TG／ML氨芐西林的LB培養(yǎng)板上篩選陽(yáng)性克隆。再通過(guò)PCR、雙酶切及測(cè)序方法對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明成功構(gòu)建了PMDL8TIL21重組克隆載體，且無(wú)基因突變。2重組表達(dá)載體PET30AIL一21的構(gòu)建及對(duì)RHLL21表達(dá)條件的優(yōu)化

簡(jiǎn)介：華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文X射線和喜樹(shù)堿對(duì)外周血淋巴細(xì)胞不同細(xì)胞亞群生物學(xué)效應(yīng)的研究姓名田銘申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專(zhuān)業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師龔建平201104華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文2殖期的PBLSΓH2AX表達(dá)較靜止期多，這表明增殖期PBLS較靜止期損傷更明顯，放化療敏感性更顯著。同時(shí)我們通過(guò)兩組凋亡率的比較也發(fā)現(xiàn)，增殖期細(xì)胞的死亡更多，其相關(guān)蛋白BCL2，CASPASE9和CASPASE3的表達(dá)也與該現(xiàn)象相符。為了明確H2AX在上述生物過(guò)程中的作用，通過(guò)RNAI技術(shù)在293T中抑制H2AX的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)CPT和XRAY誘導(dǎo)的凋亡無(wú)顯著影響，故H2AX可能僅作為DNA損傷的標(biāo)志蛋白，而不參與凋亡途徑的調(diào)控。本研究旨在通過(guò)以正常人的PBLS為模型模擬腫瘤細(xì)胞的不同細(xì)胞亞群，研究損傷因子（XRAY和CPT）對(duì)不同細(xì)胞周期狀態(tài)的亞群細(xì)胞（靜止期和增殖期）的DNA損傷修復(fù)應(yīng)答反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步揭示不同細(xì)胞周期狀態(tài)的亞群細(xì)胞在外界損傷因子誘導(dǎo)的DNA損傷以及細(xì)胞凋亡方面存在明顯的差異，靜止期細(xì)胞容易逃避外界因子引起的DNA損傷，這對(duì)于指導(dǎo)臨床腫瘤治療有重要意義。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多CCN3在低血清誘導(dǎo)軟骨終板細(xì)胞凋亡體系中的表達(dá)及生物學(xué)作用.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：目的體外分離、培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞UMBILICALCDDERIVEDMESENCHYMALSTEMCELLS，UCMSCS，并檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD309（血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2，VEGFR2，F(xiàn)LK1）的表達(dá)，細(xì)胞分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF和前列腺素E2PGE2的量，分別分析它們與供者信息產(chǎn)婦年齡、孕周、胎兒體重和性別的相關(guān)性。方法無(wú)菌條件下收集健康胎兒臍帶，采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)UCMSCS，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)收獲細(xì)胞數(shù)量，繪制生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型，成骨成脂誘導(dǎo)分化鑒定。流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)的82份P1代細(xì)胞表面標(biāo)志物CD309表達(dá)。隨機(jī)抽取15份UCMSCS傳代培養(yǎng)至P11代。ELISA法分別檢測(cè)P1、P3、P5、P7、P10和P11代UCMSCS培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子HGF和PGE2的含量。隨機(jī)抽取28份UCMSCS擴(kuò)增培養(yǎng)，P2代細(xì)胞接種后培養(yǎng)48小時(shí)收獲，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量，分析細(xì)胞增殖能力和供者信息（產(chǎn)婦年齡、孕周、胎兒體重、性別和分娩方式）的相關(guān)性。結(jié)果培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形或紡錘形，傳代細(xì)胞形態(tài)均一，可連續(xù)傳至15代以上。通過(guò)檢測(cè)原代，P3代，P10代細(xì)胞在不同生長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞增殖量，繪制出生長(zhǎng)曲線。P1代、P3代和P7代UCMSCS的細(xì)胞表型均為CD90CD105CD166CD14CD34CD45CD79AHLADR。P3代細(xì)胞分別通過(guò)成骨和成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。不同供者來(lái)源UCMGCS的P1代細(xì)胞表面標(biāo)志物CD309表達(dá)范圍為0％160％N82，P1代細(xì)胞CD309表達(dá)率越高，其細(xì)胞增殖倍數(shù)越高。P3代上清中HGF和PGE2含量分別為26029±11680PGML、3046±841PGMLN15，P5代上清中HGF和PGE2含量分別為11660±5137PGML、2396±569PGMLN15。從P1代傳代培養(yǎng)至P11代，細(xì)胞培養(yǎng)上清中HGF含量隨傳代次數(shù)降低，PGE2含量無(wú)顯著性變化。擴(kuò)增培養(yǎng)28份UCMSCS獲得細(xì)胞增殖倍數(shù)，分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)婦年齡2426歲組增殖倍數(shù)為439±115，比3141歲組增殖倍數(shù)299±075高男性胎兒增殖倍數(shù)為392±117，比女性胎兒增殖倍數(shù)303±087高胎兒體重＜35KG組增殖倍數(shù)為389±092，比≥35KG組增殖倍數(shù)287±119高細(xì)胞增殖能力均是前者強(qiáng)于后者孕周和分娩方式的不同細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著性差異。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)出人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并傳代擴(kuò)增。不同供者來(lái)源UCMSCS細(xì)胞表面標(biāo)志物CD309表達(dá)存在差異，高表達(dá)CD309的UCMSCS細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)。不同供者來(lái)源UCMSCS分泌HGF和PEG2的量也有較大差異。隨傳代次數(shù)增加，細(xì)胞分泌的HGF量降低，P5代出現(xiàn)急劇下降，而PGE2量無(wú)明顯變化。產(chǎn)婦年齡較小、胎兒體重較輕的男性胎兒的UCMSCS細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)。

簡(jiǎn)介：中圖分類(lèi)號(hào)Q2墨UDC500碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼Q§三三密級(jí)公玨0D38在鼻咽癌側(cè)群細(xì)胞中高表達(dá)并通過(guò)影響ZAP70信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)CD38ISHIGHLYEXPRESSEDINSIDEPOPULMIONCELLSOF●一一一一HUMANNASOPHARYNGEALCARCINOMACELLLINESANDPLAYSAROLEBYSYNERGIZINGWITHZAP70作者姓名學(xué)科專(zhuān)業(yè)研究方向?qū)W院系、所指導(dǎo)教師鄭丹薇生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)腫瘤研究所周艷宏論文答辯日期翌呈鄉(xiāng)答辯委員會(huì)主席暨莖J{一中南大學(xué)2014年5月本課題受如下基金項(xiàng)目資助2013年國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)912291222013年國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)812729752012年湖南省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)12JJ20442012年湖南省發(fā)改委項(xiàng)目LTF遺傳變異影響鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究

簡(jiǎn)介：分類(lèi)號(hào)～ⅦDC密級(jí)編號(hào)午I初大學(xué)CENTRALSOUTHUNIVERSITY碩士學(xué)位論文論文題目人胃腸薏霎曩燃SHD學(xué)科、專(zhuān)業(yè)研究生導(dǎo)師姓名及其專(zhuān)業(yè)技術(shù)職稱(chēng)普通外科劉盛廖國(guó)慶教授中南大學(xué)二。一一年五月分類(lèi)號(hào)VDC碩士學(xué)位論文密級(jí)舢F||IL||FL|L|I|LL|LL|IIIIF|ILFI『IIL|L|1|刪Y1916725人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系GISTH1的生物學(xué)特性觀察OBSERVATIONSONBIOLOGICALCHARACTERISTICSOFTHEHUMANGASTROINTESTINALSTROMAL11UMORCENLINEGIST_H1作者姓名劉盛學(xué)科專(zhuān)業(yè)普通外科學(xué)院系、所湘雅醫(yī)院指導(dǎo)教師廖國(guó)慶教授論文答辯日期2殳2答辯委員會(huì)主席中南大學(xué)二。一一年五月

簡(jiǎn)介：排汗是皮膚的重要功能之一，皮膚通過(guò)排汗來(lái)維持基礎(chǔ)代謝體溫。汗腺是皮膚的一個(gè)附屬機(jī)構(gòu)，是排汗的承擔(dān)者，沒(méi)有汗腺的皮膚如疤痕等不能排汗。隨著醫(yī)療衛(wèi)生改革和居民生活水平的提高，大面積深度燒傷病人存活率越來(lái)越高。大面積深度燒傷病人的燒傷面積可達(dá)98，病人傷愈后，在創(chuàng)面形成疤痕組織，而疤痕組織不含有汗腺，不能排汗，大大影響了病人的生活質(zhì)量。如何再生足夠量的汗腺，使病人皮膚排汗功能修復(fù)，是臨床上亟待解決的問(wèn)題。由于大面積深度燒傷病人的燒傷面積很大，不可能從病人身上取得大量的汗腺細(xì)胞，所以汗腺細(xì)胞的來(lái)源很少，并且汗腺細(xì)胞是體細(xì)胞，在體外難以實(shí)施擴(kuò)增培養(yǎng)。所以本論文旨在通過(guò)體外分離獲得人汗腺細(xì)胞，繼而構(gòu)建人汗腺細(xì)胞來(lái)源的IPS，為獲得大量的修復(fù)汗腺的種子細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。第一部分人汗腺細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)及鑒定目的從外科手術(shù)廢棄的幼兒六指皮膚中分離獲得汗腺細(xì)胞，建立體外培養(yǎng)傳代方法，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。方法將幼兒六指皮膚除去脂肪和結(jié)締組織，剪成1MM2大小，用IV型膠原酶于37℃消化4H，在倒置顯微鏡下提取出汗腺。將汗腺干貼于6CM細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入汗腺細(xì)胞培養(yǎng)基于37℃、5CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。23D后，細(xì)胞從汗腺中長(zhǎng)出。RTPCR和免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)汗腺細(xì)胞的標(biāo)志基因和蛋白質(zhì)CEA、CK14和CK18的表達(dá)。結(jié)果人汗腺細(xì)胞呈典型的上皮細(xì)胞樣生長(zhǎng)，排列緊密，類(lèi)似鋪石路狀，細(xì)胞邊界明顯，核清晰；RTPCR和免疫熒光染色技術(shù)結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)汗腺細(xì)胞的標(biāo)志基因和蛋白CEA、CK14和CK18。結(jié)論成功建立人汗腺細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)體系，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步鑒定，為進(jìn)一步研究汗腺細(xì)胞奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。第二部分人汗腺細(xì)胞來(lái)源的IPS制備及生物學(xué)特性鑒定目的重編程人汗腺細(xì)胞為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步分析。方法取體外培養(yǎng)10D后的汗腺細(xì)胞，以1105的密度接種于6CM細(xì)胞培養(yǎng)皿中。第二天，加入含有4種胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子基因OCT4、SOX2、KLF4和CMYC的慢病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基。23D后，消化接種到鋪有滋養(yǎng)層細(xì)胞的6CM細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)約10D后，挑選克隆和細(xì)胞形態(tài)與HESC相同的克隆，接種于鋪有滋養(yǎng)層細(xì)胞的24孔板中。培養(yǎng)約10D后，再次挑選克隆和細(xì)胞形態(tài)與HESC相同的克隆，接種于鋪有滋養(yǎng)層細(xì)胞的6孔板中。RTPCR檢測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞OCT4、SOX2、KLF4、CMYC和NANONG基因表達(dá)，免疫熒光技術(shù)分析4因子轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)HESC標(biāo)志物OCT4、SSEA3、SSEA4、TRA160和TRA181的表達(dá)。結(jié)果（1）人汗腺細(xì)胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)改變，與汗腺細(xì)胞差異顯著，形成的IPS克隆，形態(tài)與HESC形態(tài)相似，細(xì)胞生長(zhǎng)緊密，邊界不明顯，核質(zhì)比高，核仁清新，在細(xì)胞周?chē)写罅看x產(chǎn)物；（2）RTPCR顯示汗腺細(xì)胞來(lái)源的IPS表達(dá)基因OCT4、SOX2、KLF4、CMYC和NANOG；（3）免疫熒光技術(shù)顯示汗腺細(xì)胞來(lái)源的IPS的OCT4、SSEA3、SSEA4、TRA160和TRA181蛋白質(zhì)表達(dá)呈陽(yáng)性。結(jié)論人汗腺細(xì)胞經(jīng)4因子轉(zhuǎn)染后，成功構(gòu)建IPS，人汗腺細(xì)胞源IPS表達(dá)HESC標(biāo)志基因和相關(guān)分子。

簡(jiǎn)介：INNUENCEOFAMMONIANITROGENANDNITRITENITROGENONTHMORCEUBIOLOGYADISSERTATIONSUBMI慨DTOMEGRADUATESCHOOLOFHENANUNIVERSI夠MP枷ALFUL舢MENTOFMEREQU沁M(jìn)咄FORTILEDE舯EOFM嬲TEROFMEDICIILEBY三覷拖ESUPERVISORPRO￡HU鋤GMCHAOSHENAPRIL，2014摘要隨著農(nóng)業(yè)化肥，工業(yè)防腐劑的廣泛應(yīng)用，自然界水體和土壤中氨氮，硝態(tài)氮，亞硝態(tài)氮含量逐年增加。亞硝酸鹽是常見(jiàn)的亞硝態(tài)氮，硫酸銨是常用的化肥，近年來(lái)在環(huán)境中負(fù)荷不斷加大。與此同時(shí)，流行病學(xué)研究顯示，氨氮污染嚴(yán)重的地區(qū)癌的發(fā)病率和死亡率逐步增高，尤其是肺癌近年來(lái)最為嚴(yán)重。深入研究氨氮與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系有非常重要的意義。目的選擇肺癌為研究對(duì)象，氨氮及亞硝酸鹽對(duì)于肺癌細(xì)胞演變的生物學(xué)作用。在模擬的腫瘤微環(huán)境中研究氨氮及亞硝態(tài)氮對(duì)于肺癌細(xì)胞的侵襲作用所起的作用。為進(jìn)一步了解亞硝酸鹽和肺癌的關(guān)系補(bǔ)充依據(jù)。方法用小鼠成纖維細(xì)胞L929和小鼠肺癌細(xì)胞LLC細(xì)胞共培養(yǎng)，體外模擬腫瘤微環(huán)境，制作細(xì)胞模型。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Q平滑肌肌動(dòng)蛋白Ⅱ一SMA表達(dá)；以亞硝酸鈉代表亞硝態(tài)氮，以硫酸銨代表氨氮。體外細(xì)胞增殖指標(biāo)采用MTT細(xì)胞增殖活性；PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期；HOECHST33258熒光染色計(jì)數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)；細(xì)胞遷移和侵襲能力判定采用劃痕實(shí)驗(yàn)和TRALLSWELL侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)合細(xì)胞爬片細(xì)胞形態(tài)變化判定上皮問(wèn)質(zhì)轉(zhuǎn)化EPITHELIALTOMESENC塒MALTRANSITION，EMT的發(fā)生。免疫熒光法檢測(cè)活性氧的含量。結(jié)果MTT結(jié)果顯示對(duì)LLC細(xì)胞，亞硝酸鈉、硫酸銨、亞硝酸鈉硫酸銨混合液有濃度依賴(lài)性增殖抑制作用氏O05，亞硝酸鈉在08MG。L～一10MGL～，細(xì)胞增殖有小幅增加；硫酸銨濃度在10MGL～18MGL～，細(xì)胞增殖有小幅增加；亞硝酸鈉和硫酸銨混合液對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用明顯比單純亞硝酸鈉組和硫酸銨組低PLO05；對(duì)L929細(xì)胞，亞硝酸鈉在08MGL～1OMGL。1濃度范圍內(nèi)，硫酸銨在1OMGL～18MGL‘1范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用；對(duì)LLC或L929細(xì)胞的促增殖作用，相同劑量，相同時(shí)間條件下，硫酸銨作用強(qiáng)于亞硝酸鈉尸005；亞硝酸鈉或硫酸銨對(duì)L929細(xì)胞促增殖作用強(qiáng)于LLC尸0。05。將L929和LLC細(xì)胞共培養(yǎng)L929LLC模擬腫瘤微環(huán)境，經(jīng)免疫組化法檢測(cè)到共培養(yǎng)體系中一些細(xì)胞的Q平滑肌肌動(dòng)蛋白QSMA表達(dá)呈陽(yáng)性，證實(shí)這些細(xì)胞已轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞CARCINOMAASSOCIATED

簡(jiǎn)介：脊髓損傷SPINALCDINJURYSCI不可避免造成神經(jīng)元死亡及其軸突斷裂進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)支配功能的喪失。支持和引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)是SCI修復(fù)的關(guān)鍵。作為支持和引導(dǎo)損傷神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的移植細(xì)胞嗅鞘細(xì)胞OLFACTYENSHEATHINGCELLSOECS具有天然的優(yōu)勢(shì)。然而SCI后膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的抑制分子形成抑制軸突再生的化學(xué)屏障膠質(zhì)細(xì)胞活化遷移在損傷部位形成的膠質(zhì)瘢痕和空洞缺損成為軸突再生的物理屏障。在此環(huán)境中移植細(xì)胞難以定向遷移和有序分布無(wú)法為再生軸突提供有效的支持和引導(dǎo)這是細(xì)胞移植修復(fù)SCI難以取得突破的重要原因。因此通過(guò)組織工程構(gòu)建仿生支架定向分布移植細(xì)胞克服損傷部位抑制分子和瘢痕空洞對(duì)軸突再生的不利影響為神經(jīng)元軸突再生提供支持和引導(dǎo)成為實(shí)現(xiàn)SCI功能修復(fù)的重要突破口也是目前SCI修復(fù)的研究熱點(diǎn)。選擇性能優(yōu)異的生物材料是研究的前提。絲素蛋白SILKFIBROINSF以其優(yōu)異的生物相容性、良好的力學(xué)性能、可控的降解和可塑性能逐漸被研究者認(rèn)知。支架仿生構(gòu)建關(guān)鍵在于對(duì)基質(zhì)材料納米結(jié)構(gòu)的調(diào)控。近年來(lái)SF的自組裝機(jī)制和納米結(jié)構(gòu)調(diào)控研究取得重大進(jìn)展?；赟F自組裝機(jī)制的研究本項(xiàng)目組獲得結(jié)構(gòu)均一的納米線結(jié)構(gòu)單元發(fā)現(xiàn)該納米線結(jié)構(gòu)對(duì)SF靜電紡絲過(guò)程的纖維直徑及走向具有重要影響可以使得SF納米纖維的直徑更為可控、取向更為有序。因此作為組織工程支架的基質(zhì)材料SF具有天然的優(yōu)勢(shì)。為探討SF納米纖維材料作為定向分布OECS的移植載體的可行性本課題就以下幾方面內(nèi)容進(jìn)行探討1建立OEC培養(yǎng)體系倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)周期內(nèi)細(xì)胞形態(tài)的變化活細(xì)胞工作站觀察OECS連續(xù)動(dòng)態(tài)的形態(tài)變化明確同一培養(yǎng)條件下OECS遷移運(yùn)動(dòng)的形態(tài)特征及其變化規(guī)律。2研究不同培養(yǎng)條件有或無(wú)血清不同增殖劑FSKOLIN或BFGF對(duì)OECS的形態(tài)及其遷移能力的影響明確不同培養(yǎng)條件下OECS遷移運(yùn)動(dòng)的形態(tài)特征及其變化規(guī)律分析OECS遷移的調(diào)控機(jī)制。3靜電紡絲工藝制備桑蠶絲BSF和柞蠶絲TSF納米纖維支架檢測(cè)比較并評(píng)價(jià)兩種支架材料對(duì)OECS的形態(tài)、增殖、存活及其表型的影響明確SF納米纖維支架的生物相容性及其優(yōu)越性的具體體現(xiàn)。4掃描電鏡觀察SF支架及細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及其分布免疫熒光染色顯示細(xì)胞表型及細(xì)胞骨架的發(fā)育活細(xì)胞工作站連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)特征明確其變化規(guī)律分析細(xì)胞遷移軌跡、遷移速度、遷移速率等研究靜電紡SF納米纖維支架的不同種類(lèi)TSF與BSF、不同直徑400NM和1200NM和不同取向分布平行有序排列和無(wú)序網(wǎng)絡(luò)狀及空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)OECS遷移運(yùn)動(dòng)的影響明確SF納米纖維支架定向分布OECS的調(diào)控作用及其機(jī)制。5RTPCR檢測(cè)OECS的MBP、NGF、GDNF、BDNF、NCAM、VEGF的基因表達(dá)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液上清中的蛋白含量明確SF納米纖維定向分布的OECS表達(dá)功能基因和蛋白量的變化分析其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能。6探討SF納米纖維定向分布OECS對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的影響明確定向分布OECS的生物學(xué)功能為進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)及其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過(guò)上述研究本課題得出如下結(jié)論并分析其原因、意義及啟示1通過(guò)活細(xì)胞工作站連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)在同一培養(yǎng)條件下OECS遷移過(guò)程中表現(xiàn)出多樣性變化的形態(tài)特征。分析細(xì)胞形態(tài)變化與遷移運(yùn)動(dòng)之間的關(guān)系明確OECS多樣性的形態(tài)表現(xiàn)是由其功能狀態(tài)決定的不同形態(tài)的OECS適應(yīng)不同的功能狀態(tài)細(xì)長(zhǎng)突起及梭形胞體形態(tài)有利于細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)扁平狀有利于胞體鋪展黏附圓球狀有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。OECS遷移運(yùn)動(dòng)的形態(tài)特征及其變化規(guī)律更加合理地解釋OECS的形態(tài)多樣性。在電鏡、光鏡和免疫染色觀察細(xì)胞的形態(tài)都是相對(duì)靜止和固定的因而難以區(qū)分和正確理解細(xì)胞形態(tài)的多樣性是由于細(xì)胞適應(yīng)其自身功能需要而形變的結(jié)果。進(jìn)一步明確OECS形態(tài)變化與遷移運(yùn)動(dòng)功能之間的相互關(guān)系有助于理解OECS遷移的調(diào)控機(jī)制。2通過(guò)研究不同培養(yǎng)條件對(duì)OECS的形態(tài)及其遷移能力的影響明確OECS具有優(yōu)異的可塑性。OECS自胞體伸出微小突起感知周?chē)h(huán)境信號(hào)變化從而改變自身形態(tài)以適應(yīng)環(huán)境變化進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞不同功能的表達(dá)。無(wú)血清條件培養(yǎng)液、FSKOLIN和BFGF有利于OECS運(yùn)動(dòng)功能的表達(dá)提高了細(xì)胞的遷移速度。由于OECS遷移缺乏有效引導(dǎo)遷移軌跡和遷移方向是隨機(jī)和無(wú)規(guī)律性的呈現(xiàn)無(wú)規(guī)行走。實(shí)現(xiàn)信號(hào)分子的濃度梯度分布或是構(gòu)建模擬細(xì)胞外基質(zhì)三維納米空間結(jié)構(gòu)的仿生支架是體外引導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞定向遷移的有效途徑。3SF尤其是TSF納米纖維支架具有良好的生物相容性能夠促進(jìn)OECS黏附、生長(zhǎng)與增殖。分析原因SF納米纖維支架高的表面與體積比率、表面活性和優(yōu)異的親水性能有利于支架材料吸附培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)分子和其它生物活性物質(zhì)從而促進(jìn)細(xì)胞在支架表面黏附進(jìn)而有利于細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)與增殖。TSF納米纖維具有更為優(yōu)異的生物相容性與其含有豐富的精氨酸甘氨酸天冬氨酸RGD三肽序列有關(guān)RGD序列是人類(lèi)細(xì)胞外基質(zhì)中廣泛存在的能夠被細(xì)胞表面受體識(shí)別和特異性結(jié)合的序列作為細(xì)胞膜整合素受體與細(xì)胞外配體相結(jié)合的識(shí)別位點(diǎn)介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞之間的相互作用能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)支架的黏附進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。TSF富含RGD三肽的特性賦予其更為優(yōu)異的生物學(xué)性能。4SF納米纖維的直徑、取向分布及空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)定向分布OECS的調(diào)控作用。OECS對(duì)BSF和TSF納米纖維的不同直徑大小、取向分布及三維空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)存在不同的生物學(xué)響應(yīng)。小直徑400納米對(duì)促進(jìn)細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、增殖及遷移都有更為優(yōu)異的表現(xiàn)。分析原因OECS依賴(lài)于其突起尋路及附著其細(xì)小的突起更容易黏附于小直徑的納米纖維之上進(jìn)而有利于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及遷移等生物學(xué)功能。平行排列的納米纖維有利于引導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞遷移軌跡和方向細(xì)胞沿納米纖維的取向形成有序分布在同一根纖維上細(xì)胞間的突起相互連接從而細(xì)長(zhǎng)串珠樣結(jié)構(gòu)。分析原因平行排列的納米纖維結(jié)構(gòu)能夠使細(xì)胞的突起在尋路過(guò)程中不易被其它纖維或細(xì)胞影響和干擾因而在遷移過(guò)程中能夠保持較好的方向性引導(dǎo)細(xì)胞在支架材料上定向遷移并有序分布。從超微結(jié)構(gòu)觀察細(xì)胞在支架三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中的狀態(tài)能夠提示支架的孔隙大小、纖維間的距離及排列方式對(duì)細(xì)胞的形態(tài)及功能也有重要影響這對(duì)于構(gòu)建體內(nèi)應(yīng)用的支架有著重要的啟示意義。目前SF納米纖維的直徑能夠控制在50納米級(jí)別同時(shí)纖維取向分布更為有序今后將更為深入探討纖維直徑、取向及三維空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)OECS生物學(xué)行為的影響以進(jìn)一步優(yōu)化支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。5SF納米纖維調(diào)控OECS定向遷移和有序分布與細(xì)胞骨架的排列方式密切相關(guān)。從細(xì)胞骨架形態(tài)及其分布的觀察可以看出生長(zhǎng)在SF納米纖維上的OECS細(xì)胞骨架發(fā)育理想微管蛋白排列整齊表明細(xì)胞可以感受生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)SF納米纖維支架具有很好的反應(yīng)而且對(duì)小直徑平行排列的TSF納米纖維的反應(yīng)更強(qiáng)。同時(shí)提示OECS對(duì)基質(zhì)環(huán)境的響應(yīng)是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞骨架的形成及其架構(gòu)從而控制細(xì)胞的形態(tài)變化如突起的延伸及回縮胞體的形變進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的遷移并控制細(xì)胞遷移的方向引導(dǎo)細(xì)胞在支架材料上形成有序分布。6TSF納米纖維支架有利于OECS功能基因和蛋白的表達(dá)。TSF納米纖維支架為細(xì)胞提供的生長(zhǎng)環(huán)境有利于細(xì)胞合成與分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞黏附分子及可溶性趨化因子使得細(xì)胞能夠在支架上遷移和相互聚集細(xì)胞間形成更多的通訊聯(lián)接。同時(shí)TSF納米纖維支架促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的作用還可以進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。7定向分布OECS支持神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育引導(dǎo)神經(jīng)元軸突延伸。支持和引導(dǎo)神經(jīng)元及其軸突的生長(zhǎng)及延伸是OECS在體內(nèi)嗅覺(jué)神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育及損傷再生過(guò)程中作為細(xì)胞底物作用的關(guān)鍵也是其應(yīng)用于移植修復(fù)SCI的重要理論基礎(chǔ)。體外構(gòu)建SF仿生支架定向分布OECS支持神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育引導(dǎo)神經(jīng)元軸突延伸是本課題研究的目的也是其研究?jī)r(jià)值的核心體現(xiàn)。天然細(xì)胞外基質(zhì)的纖維尺寸為50500NM進(jìn)一步控制納米纖維的直徑及取向最大程度地仿生體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)是今后研究的重要內(nèi)容?；赟F自組裝機(jī)制研究的突破具有天然細(xì)胞外基質(zhì)膠原納米纖維結(jié)構(gòu)的SF納米纖維水凝膠的成型機(jī)理及其制備技術(shù)是本課題今后的研究方向。此外利用SF納米纖維載藥緩釋技術(shù)負(fù)載相關(guān)蛋白因子賦予支架生物活性是實(shí)現(xiàn)SF仿生支架修復(fù)SCI取得突破的重要環(huán)節(jié)。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多基于TGF-β-Smads信號(hào)通路研究LIPUS介導(dǎo)威靈仙對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：分類(lèi)號(hào)密級(jí)單位代碼10114學(xué)號(hào)200910071NFKB抑制劑對(duì)宮頸癌細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響研究指導(dǎo)教師昱塞墓熬撞申請(qǐng)學(xué)位門(mén)類(lèi)級(jí)別科堂堂僮專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)塑亡整堂研究方向塑科鼬瘙所在學(xué)院出酉醫(yī)科太堂篁二監(jiān)鏖醫(yī)堂隨2012年3月18日目錄中文摘要I英文摘要II英文名詞縮略表Ⅲ1上一JL刖舌1第一部分MIF、NFKB在人兩種不同宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)一免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)MIF、NF迅在人兩種不同宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)3實(shí)驗(yàn)二WESTEMBLOTTING法檢測(cè)MIF、NFKB在人兩種不同宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)5實(shí)驗(yàn)三ELISA檢測(cè)MIF、NF1B在人兩種不同宮頸癌細(xì)胞株上清液中的表達(dá)9討論10第二部分NFKB抑制劑PDTC對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株CASKI細(xì)胞增殖及趨化能力的影響實(shí)驗(yàn)一MTT法觀察PDTC對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株CASKI細(xì)胞增殖能力的影響13實(shí)驗(yàn)二BOYDEN小室觀察PDTC對(duì)人宮頸癌CASKI細(xì)胞趨化能力的影響15討論16第三部分NFKB抑制劑PDTC對(duì)MIF及轉(zhuǎn)移相關(guān)因子在人宮頸癌細(xì)胞株CASL【I細(xì)胞中的表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)一免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)PDTC干預(yù)CASKI細(xì)胞中MIF及轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)18實(shí)驗(yàn)二WESTERNBLOTTING法檢測(cè)PDTC干預(yù)CASKI細(xì)胞中MIF及轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)一20實(shí)驗(yàn)三ELISA法檢PDTC干預(yù)CASKI細(xì)胞中MIF及轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的蛋白含量的變化22討論23結(jié)論25參考文獻(xiàn)26綜述29個(gè)人簡(jiǎn)介35致謝36

簡(jiǎn)介：第三軍醫(yī)大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明秉承學(xué)校嚴(yán)謹(jǐn)?shù)男ｏL(fēng)和科研作風(fēng)，本人申明所呈交的論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料，與我同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名駐日期之必業(yè)第三軍醫(yī)大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本人完全了解第三軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬第三軍醫(yī)大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為第三軍醫(yī)大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。學(xué)校可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容保密內(nèi)容除外，可以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名翌邀指導(dǎo)教師簽名旦2翌主璽日期山I；∞IY55小結(jié)79全文總結(jié)80參考文獻(xiàn)8L文獻(xiàn)綜述自噬與凋亡之間的平衡與腫瘤一90參考文獻(xiàn)一99博士期間發(fā)表及待發(fā)表文章109致謝110

簡(jiǎn)介：目的聯(lián)合采用免疫磁珠及流式細(xì)胞術(shù)分選豬骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞VSELS鑒定其生物學(xué)特性，并探尋體外培養(yǎng)、擴(kuò)增豬骨髓VSELS的方法。方法常規(guī)消毒、麻醉后穿刺豬髂后上棘獲取骨髓，使用紅細(xì)胞裂解法獲得豬骨髓單個(gè)核細(xì)胞，運(yùn)用分別耦合了CD133和LIN抗體的磁珠進(jìn)行免疫磁珠分選，對(duì)所得的CD133細(xì)胞群和LIN細(xì)胞群標(biāo)記熒光抗體CD133、CD45及LIN，進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選獲得VSELS，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析兩種分選方法的效率，并探討聯(lián)合分選的價(jià)值使用光學(xué)顯微鏡及透射電鏡觀察豬骨髓VSELS的形態(tài)特征和超微結(jié)構(gòu)，運(yùn)用堿性磷酸酶染色和免疫熒光染色的方法鑒定其多能干細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)同時(shí)采用條件培養(yǎng)基對(duì)豬骨髓VSELS進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，觀察VSELS的貼壁及增殖情況。結(jié)果聯(lián)合采用免疫磁珠與流式細(xì)胞分選術(shù)能夠高效的分選出豬骨髓VSELS，且使用CD133陽(yáng)性分選較LIN陰性分選效率更高，但聯(lián)合分選有費(fèi)用高昂、細(xì)胞容易污染等缺點(diǎn)豬骨髓VSELS約占總單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量的001％003％，該細(xì)胞體積較小、形態(tài)均一，呈二倍體核型、核大而細(xì)胞質(zhì)少、核質(zhì)比高，能夠表達(dá)多能抗原標(biāo)志OCT4、NANOG和SOX2，同時(shí)堿性磷酸酶染色陽(yáng)性VSELS經(jīng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后34小時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)23周仍無(wú)明顯增殖。結(jié)論免疫磁珠及流式細(xì)胞術(shù)能夠快速的從豬骨髓中分選出數(shù)量較多、純度較高的VSELS該細(xì)胞能表達(dá)胚胎樣干細(xì)胞的特異性抗原標(biāo)志，其生物學(xué)特性類(lèi)似于胚胎干細(xì)胞，不易于體外培養(yǎng)、擴(kuò)增。

簡(jiǎn)介：學(xué)位論文脂聯(lián)素對(duì)人乳腺癌脂聯(lián)素對(duì)人乳腺癌MCFMCF7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其所誘導(dǎo)的凋亡與自噬相關(guān)性的研究所誘導(dǎo)的凋亡與自噬相關(guān)性的研究THEEFFECTOFADIPONECTINONTHEBIOLOGYTHEEFFECTOFADIPONECTINONTHEBIOLOGYBEHAVIORSOFTHEMCFBEHAVIORSOFTHEMCF7CELLANDTHERELATIONSHIP7CELLANDTHERELATIONSHIPOFTHEINDUCEDAPOPTOSISANDAUTOPHAGYOFTHEINDUCEDAPOPTOSISANDAUTOPHAGY劉佳2015年05月UDC編號(hào)指導(dǎo)教師姓名指導(dǎo)教師姓名王佑民教授安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)名專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)內(nèi)科學(xué)（內(nèi)分泌與代謝?。┨峤徽撐娜掌谔峤徽撐娜掌?0150317論文答辯日期論文答辯日期20150510學(xué)位授予單位和日期學(xué)位授予單位和日期安徽醫(yī)科大學(xué)答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)主席評(píng)閱人安徽醫(yī)科大學(xué)ANHUIMEDICALUNIVERSITY碩士學(xué)位論文脂聯(lián)素對(duì)人乳腺癌脂聯(lián)素對(duì)人乳腺癌MCFMCF7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其所誘導(dǎo)的凋亡與自噬相關(guān)性的研究所誘導(dǎo)的凋亡與自噬相關(guān)性的研究THEEFFECTOFADIPONECTINONTHEBIOLOGYTHEEFFECTOFADIPONECTINONTHEBIOLOGYBEHAVIORSBEHAVIORSOFTHEMCFOFTHEMCF7CELLANDTHERELATIONSHIP7CELLANDTHERELATIONSHIPOFTHEINDUCEDAPOPTOSISANDAUTOPHAGYOFTHEINDUCEDAPOPTOSISANDAUTOPHAGY作者姓名作者姓名劉佳指導(dǎo)教師指導(dǎo)教師王佑民王佑民教授教授學(xué)科、專(zhuān)業(yè)學(xué)科、專(zhuān)業(yè)內(nèi)科學(xué)科學(xué)（內(nèi)分泌與代謝?。▋?nèi)分泌與代謝?。┭芯糠较蜓芯糠较蛱悄虿∨c腫瘤糖尿病與腫瘤論文工作時(shí)間論文工作時(shí)間2013年9月至月至2015年3月