CD38在鼻咽癌側群細胞中高表達并通過影響ZAP70信號通路發(fā)揮其生物學效應.pdf

1、[目的]
　　通過對鼻咽癌側群細胞（SP細胞）的鑒定和生物學功能研究，探討CD38在鼻咽癌側群細胞中的作用及其可能機制。
　　[方法]
　　利用貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter)MoFloTM XDP型超高速細胞分選平臺，鑒定、分選鼻咽癌細胞系SP細胞。在此基礎上，采用流式細胞術、microRNA芯片、實時定量PCR、WesternBlotting等方法，分別從mRNA、microRNA和蛋白質表達水平

2、等不同層面，研究鼻咽癌SP細胞的生物學特性、CD38在鼻咽癌側群細胞中的表達水平及其可能作用機制。
　　[結果]
　　1.人鼻咽癌細胞系中SP細胞的鑒定及其生物學特性分析。
　　利用SP細胞外排熒光活性染料Hoechst33342的特性，我們鑒定了4種鼻咽癌細胞系HK-1、C666-1、HNE1和HNE2中SP細胞的比例，結果發(fā)現(xiàn)HK-1和C666-1兩種細胞系中SP細胞比例較高，分別為5.2±0.72％和0.46±0

3、.07％，而HNE1和HNE2細胞系中比例較低，分別為0.01％和0.02％。接下來我們選擇SP細胞比例較高的HK-1細胞進行后續(xù)研究。SP細胞因其高表達ABC轉運蛋白能夠外排Hoechst33342，我們使用ABC轉運蛋白抑制劑維拉帕米，能夠很好地抑制染料外排作用，從而降低SP細胞比例。
　　為了進一步研究SP細胞的生物學特性，本研究利用流式細胞儀成功分選了SP和NSP(non-side population cell，NSP)

4、細胞，并發(fā)現(xiàn)CD133、OCT4、ALDH1 A1、CD38等腫瘤干細胞標志物在SP細胞中表達上調。此外，SP細胞具有較強的細胞增殖和自我更新能力、侵襲和遷移能力、細胞周期主要分布于G0/G1期等腫瘤干細胞相似的生物學特性。
　　2.鼻咽癌HK-1細胞系中SP和NSP細胞差異microRNAs表達譜研究。
　　我們利用microRNA芯片（Agilent Human miRNA芯片18.0版本）檢測鼻咽癌HK-1細胞系中SP

5、和NSP細胞microRNA表達情況，結果發(fā)現(xiàn):在檢測的1887個miRNA分子中，有84個miRNA分子表達存在差異，其中有5個miRNA分子(hsv2-miR-H10，miR-572，miR-3656，miR-638，miR-2861)表達上調，79個miRNA分子（miR-374b-5p，miR-140-5p，miR-1470等）表達下調。在差異表達的microRNAs中有94.05％ microRNAs在SP細胞中表達下調。隨后

6、qRT-PCR實驗也證實miR-634，miR-664，miR-140-5p，miR-4317，miR-3646，miR-582-5p等miRNA分子在鼻咽癌SP和NSP細胞中存在表達差異。通過TargetScan（http://www.targetscan.org）等網(wǎng)站預測，我們發(fā)現(xiàn)這些差異microRNAs中許多分子與干細胞標志物有關，如:miR-634,miR-664,miR-140-5p調控CD38; miR-4317, mi

7、R-3646,miR-582-5p調控CD24; miR-30a調控CD133; miR-532調控CD44;miR-125b調控CD90等。我們還采用流式細胞術對鼻咽癌SP和NSP細胞表面及胞內(nèi)干細胞標志物蛋白表達水平進行了分析，發(fā)現(xiàn)CD44、CD24、CD38、CK19在SP細胞表面高表達，CD133、CD24、CD90、CD38、CD21在SP細胞內(nèi)高表達。結合microRNAs芯片結果提示，這些差異microRNAs與干細胞標志

8、物蛋白水平的表達呈負相關?；谏鲜鲅芯拷Y果，我們發(fā)現(xiàn)CD38分子的表達水平在SP和NSP細胞中存在較大差異，因此推測CD38分子介導的相關信號通路在SP細胞中發(fā)揮了生物學效應。
　　3.CD38通過影響ZAP70信號通路發(fā)揮其生物學效應
　　CD38通過多種途徑與CXCR4、CXCL12、CD31、CD49D、MMP-9和ZAP70等分子相互作用，調節(jié)腫瘤進程。我們從mRNA水平檢測并發(fā)現(xiàn)CD38分子作用網(wǎng)絡中CXCR4、Z

9、AP70、CD31、CD49D、MMP-9在SP細胞中表達上調，其中CXCR4上調11倍（t=5.355，p=0.0003）、CD31上調3.3倍(t=3.559，p=0.0061)、CD49D上調1.5倍(t=2.754，p=0.0362)、MMP-9上調3.2倍(t=2.602，p=0.0482)、ZAP70上調1.3倍（t=5.584，p＜0.0001）。隨后我們利用Western Blotting方法檢測并發(fā)現(xiàn)CD38及其下游調

10、控分子ZAP70蛋白在SP細胞中表達增高。我們研究結果提示CD38可能通過影響ZAP70發(fā)揮其生物學效應。
　　[結論]
　　(1)成功鑒定鼻咽癌細胞系HK-1、C666-1中SP細胞的比例分別為5.2±0.72％和0.46±0.07％;證實鼻咽癌SP細胞具有腫瘤干細胞相似的生物學特性。
　　(2)成功構建鼻咽癌SP和NSP細胞的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-634，miR-664，miR-140-5p等miRNA在S