氨氮、亞硝態(tài)氮對腫瘤細胞生物學的影響.pdf

1、隨著農業(yè)化肥，工業(yè)防腐劑的廣泛應用，自然界水體和土壤中氨氮，硝態(tài)氮，亞硝態(tài)氮含量逐年增加。亞硝酸鹽是常見的亞硝態(tài)氮，硫酸銨是常用的化肥，近年來在環(huán)境中負荷不斷加大。與此同時，流行病學研究顯示，氨氮污染嚴重的地區(qū)癌的發(fā)病率和死亡率逐步增高，尤其是肺癌近年來最為嚴重。深入研究氨氮與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關系有非常重要的意義。
　　目的:選擇肺癌為研究對象，氨氮及亞硝酸鹽對于肺癌細胞演變的生物學作用。在模擬的腫瘤微環(huán)境中研究氨氮及亞硝態(tài)氮對于

2、肺癌細胞的侵襲作用所起的作用。為進一步了解亞硝酸鹽和肺癌的關系補充依據。
　　方法:用小鼠成纖維細胞L929和小鼠肺癌細胞LLC細胞共培養(yǎng)，體外模擬腫瘤微環(huán)境，制作細胞模型。免疫細胞化學法檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達;以亞硝酸鈉代表亞硝態(tài)氮，以硫酸銨代表氨氮。體外細胞增殖指標采用MTT細胞增殖活性;PI染色流式細胞術分析細胞周期;Hoechst33258熒光染色計數細胞分裂指數;細胞遷移和侵襲能力判定采用劃痕實驗和Tr

3、answell侵襲實驗，結合細胞爬片細胞形態(tài)變化判定上皮間質轉化（epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT）的發(fā)生。免疫熒光法檢測活性氧的含量。
　　結果:MTT結果顯示:對LLC細胞，亞硝酸鈉、硫酸銨、亞硝酸鈉硫酸銨混合液有濃度依賴性增殖抑制作用(P＜0.05)，亞硝酸鈉在0.8mg·L-1-1.0mg·L-1，細胞增殖有小幅增加;硫酸銨濃度在1.0mg·L-1-1.8mg·L-1，細胞增殖

4、有小幅增加;亞硝酸鈉和硫酸銨混合液對細胞增殖抑制作用明顯比單純亞硝酸鈉組和硫酸銨組低(P＜0.05);對L929細胞，亞硝酸鈉在0.8mg·L-1-1.0mg·L-1濃度范圍內，硫酸銨在1.0mg·L-1-1.8mg·L-1范圍內對細胞增殖有促進作用;對LLC或L929細胞的促增殖作用，相同劑量，相同時間條件下，硫酸銨作用強于亞硝酸鈉（P＜0.05）;亞硝酸鈉或硫酸銨對L929細胞促增殖作用強于LLC（P＜0.05）。將L929和LLC

5、細胞共培養(yǎng)(L929-LLC)模擬腫瘤微環(huán)境，經免疫組化法檢測到共培養(yǎng)體系中一些細胞的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達呈陽性，證實這些細胞已轉化為腫瘤相關成纖維細胞(carcinoma-associatedfibroblasts，CAFs）。經MTT結果顯示對L929-LLC細胞，亞硝酸鈉在0.8mg·L-1-1.0mg·L-1，對細胞增殖有促進作用;硫酸銨濃度在1.0mg·L-1-1.8mg·L-1，48小時，對細胞增殖有促進作用

6、，亞硝酸鈉或硫酸銨對L929-LLC細胞促增殖作用強于單獨培養(yǎng)的LLC和L929細胞（P＜0.05）;亞硝酸鈉和硫酸銨混合液濃度在0.1mg·L-1-1.8mg·L-1對細胞增殖有促進作用，其中濃度在1.8mg·L-1時，對細胞增殖促進作用最顯著(P＜0.05);1.8mg·L-1亞硝酸鈉硫酸銨混合溶液(1∶1)對L929-LLC細胞促增殖作用強于單獨用硫酸銨組，而硫酸銨組又強于單純亞硝酸鈉組(P＜0.05)。亞硝酸鈉、硫酸銨、亞硝酸鈉

7、硫酸銨混合液對細胞增殖無抑制作用。分別將0.8mg·L-1濃度的亞硝酸鈉、1.0mg·L-1濃度硫酸銨、1.8mg·L-1亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液加入L929-LLC中48小時，PI染色，流式細胞術分析發(fā)現:S期加G2期細胞所占比例分別為(9.13±1.54)％、(10.17±2.10)％、(16.32±1.13)％，與各自空白對照組相比，差異明顯(P＜0.05)，其中，亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液處理的L929-LLC細胞S期加G2期細胞

8、所占比例高于硫酸銨組，而硫酸銨組高于單純亞硝酸鈉組(P＜0.05);Hoechst33258熒光染色，顯微鏡下計數細胞分裂指數發(fā)現:細胞分裂指數分別為(13.41±4.17)％、(15.2±3.75)％、(18.78±4.91)％，與各自空白對照組相比，差異明顯(P＜0.05)，其中，亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液處理的L929-LLC細胞分裂指數高于硫酸銨組，而硫酸銨組又高于單純亞硝酸鈉組(P＜0.05);倒置顯微鏡下發(fā)現:亞硝酸鈉和硫酸銨

9、混合溶液處理L929-LLC細胞48小時，大批細胞呈細長的梭形，梭形細胞數量明顯比單純硫酸銨組多，單純亞硝酸鈉組梭形細胞數相對較少;劃痕實驗結果顯示:亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液處理的L929-LLC細胞劃痕愈合的相對距離高于硫酸銨組，而硫酸銨組又高于單純亞硝酸鈉組(P＜0.05);Transwell細胞侵襲實驗顯示:穿過基底膜的細胞數個數分別為90±2.94，114±3.43，132±3.96，與各自空白對照組相比，差異明顯(P＜0.05

10、)。亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液處理的L929-LLC穿膜細胞數高于硫酸銨組，而硫酸銨組高于亞硝酸鈉組(P＜0.05)。免疫熒光檢測活性氧結果顯示:亞硝酸鈉組、硫酸銨組、亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液組都明顯高于空白對照組，亞硝酸鈉和硫酸銨混合溶液處理的L929-LLC熒光強度高于亞硝酸鈉組，而硫酸銨組高于亞硝酸鈉組(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.亞硝酸鈉和硫酸銨單獨應用或混合應用，對L929-LLC共培養(yǎng)細胞有促增殖作用，亞