溴化乙錠誘導(dǎo)培養(yǎng)對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其誘導(dǎo)線粒體降解的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)存在的雙層膜細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)代謝和能量產(chǎn)生的中心環(huán)節(jié)，同時(shí)還是不同細(xì)胞信號(hào)通路的通信站。實(shí)際上，線粒體的功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止于此，他還是氧化磷酸化的副產(chǎn)物-內(nèi)源性活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)的主要來(lái)源。過(guò)量的ROS具有潛在毒性，可能導(dǎo)致線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)、線粒體DNA及脂質(zhì)損害，甚至可能通過(guò)活化內(nèi)源性凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，線粒體還與線粒體功能紊亂、心臟功能障礙、衰老

2、和其他疾病相關(guān)。因此，線粒體的數(shù)量和功能都需要受到精確調(diào)控，以發(fā)揮維持細(xì)胞能量代謝穩(wěn)態(tài)及其他細(xì)胞關(guān)鍵進(jìn)程的作用。到目前為止，已經(jīng)有證據(jù)表明自噬引起的選擇性線粒體降解在調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量和功能方面發(fā)揮著重要作用。因此，線粒體與自噬之間的關(guān)系在于自噬可以選擇性清除異常增多或者受到損害的線粒體，這一過(guò)程又叫做線粒體自噬。
　　最開(kāi)始研究自噬的時(shí)候，一般認(rèn)為其在細(xì)胞內(nèi)是一保護(hù)性過(guò)程。基礎(chǔ)水平的自噬通過(guò)再循環(huán)和利用細(xì)胞內(nèi)成分在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)

3、揮著重要的作用。發(fā)展到現(xiàn)在，有關(guān)自噬的研究已經(jīng)超出最初的定義，廣泛應(yīng)用于生理及病理學(xué)的研究。例如，自噬水平異常升高可能與一系列病理過(guò)程相關(guān)，如感染、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、衰老及腫瘤等。有關(guān)自噬與腫瘤的研究中，Beclin-1是最早發(fā)現(xiàn)的把自噬和腫瘤聯(lián)系起來(lái)的基因，并在剛發(fā)現(xiàn)時(shí)將其定義為腫瘤抑制基因。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，包括MAP-1-LC3和HsGSA7等在內(nèi)的其他一些自噬相關(guān)基因(ATG)也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。與自噬相關(guān)基因

4、相對(duì)應(yīng)，自噬相關(guān)蛋白是自噬過(guò)程中的必需因子。微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)酵母Atg8的同源物，通過(guò)剪切體內(nèi)新合成PorLC3C端氨其酸形成LC3-Ⅰ。進(jìn)而，具有E2樣酶活性的Atg7再將LC3-ⅠC端的22個(gè)氨基酸剪切，形成LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ直接參與自噬體的合成，并且是自噬現(xiàn)象的標(biāo)志性蛋白。
　　正常情況下，基礎(chǔ)水平的自噬通過(guò)生理性清除受損細(xì)胞器和長(zhǎng)壽命蛋白維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，而在代謝應(yīng)激或能量危機(jī)如營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子或

5、氧氣剝奪，抑或線粒體損害時(shí)，自噬途徑被持續(xù)激活。我們知道，線粒體在細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂及能量代謝等過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。顯而易見(jiàn)，線粒體的這些功能也是腫瘤細(xì)胞增殖、存活及轉(zhuǎn)移所必需的。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在血清饑餓條件下，自發(fā)線粒體膜電位去極化的頻率是增加的，這些受損的線粒體進(jìn)入酸性液泡，被自噬體和自噬溶酶體內(nèi)捕獲及降解。為研究肺癌細(xì)胞的能量代謝，我們通過(guò)低劑量溴化乙錠(ethidiumbromide，EtBr)誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法敲逐步敲除線粒體

6、DNA，在線粒體DNA逐步缺失的過(guò)程中，我們研究發(fā)現(xiàn)線粒體數(shù)量大量減少，線粒體膜電位下降，更重要的是，在誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)志物明顯增高。因此，我們推測(cè)在EtBr誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞線粒體DNA敲除過(guò)程中，自噬通路被激活，并可能是線粒體降解的機(jī)制之一。因此，本文研究在使用低劑量EtBr誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞線粒體DNA缺失過(guò)程中，研究mtDNA缺失程度對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及進(jìn)一步探討線粒體降解的可能機(jī)制。
　　研究方法:
　　

7、1.肺癌細(xì)胞低劑量EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)及線粒體DNA缺失程度的鑒定
　　人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、SPC-A1和H322在含有10％的FBS及雙抗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90％～95％時(shí)進(jìn)行傳代。為逐步敲除線粒體DNA，細(xì)胞培養(yǎng)基中加入250ng/ml的溴化乙錠，連續(xù)培養(yǎng)7天，培養(yǎng)時(shí)隔天換液。同時(shí)，培養(yǎng)基中額外加入50μg/ml的尿嘧啶和100μg/ml的丙酮酸鈉。分別收集EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)前，及培養(yǎng)后第1、3、5和7天的肺癌細(xì)胞，

8、通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肺癌細(xì)胞中線粒體DNA含量及COXⅡ的mRNA表達(dá)水平。另外鑒定EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后肺癌細(xì)胞對(duì)尿嘧啶的營(yíng)養(yǎng)依賴(lài)特性。
　　2.線粒體DNA缺失程度對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　人肺癌細(xì)胞A549、SPC-A1和H322在含EtBr的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)1、3、5和7天，將細(xì)胞用胰酶消化并計(jì)數(shù)，分別進(jìn)行細(xì)胞增殖、克隆形成及細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)肺癌細(xì)胞mtDNA敲除過(guò)程中細(xì)胞的增殖及遷移能力。此外，通過(guò)PⅠ

9、染色和AnnexinV-FITC染色進(jìn)行流式檢測(cè)，分別測(cè)定不同mtDNA缺失程度肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和早期凋亡水平的改變。同時(shí)，我們?cè)隗w內(nèi)研究mtDNA缺失不同程度肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。首先，用NOD/SCID小鼠建立肺癌細(xì)胞的皮下異種移植模型，每只小鼠在左側(cè)皮下注射1×106個(gè)EtBr處理不同時(shí)間的細(xì)胞，待腫瘤體積肉眼可見(jiàn)后每周測(cè)量?jī)纱文[瘤體積，到限值時(shí)處死小鼠，取出腫瘤測(cè)量腫瘤直徑及計(jì)算體積。
　　3.EtBr誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞線粒體降

10、解的鑒定
　　首先，用激光共聚焦驗(yàn)證線粒體的溶酶體降解過(guò)程。EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時(shí)間的肺癌細(xì)胞在檢測(cè)前20分鐘同時(shí)加入200nM的綠色線粒體熒光探針和200nM的紅色溶酶體熒光探針，孵育結(jié)束后用新鮮配置的PBS溶液洗滌三遍。隨后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，共聚焦圖像以2μm間隔進(jìn)行采集。然后，使用TMRM熒光探針和JC-1熒光探針?lè)跤?xì)胞，分別通過(guò)激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位的變化情況。最后，將EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)后的肺

11、癌細(xì)胞固定染色，在透射電鏡下進(jìn)一步研究EtBr引起的線粒體數(shù)量及超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　4.EtBr誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞線粒體降解的機(jī)制研究
　　首先，通過(guò)LTR、MTG雙色熒光探針共定位技術(shù)分析線粒體的降解途徑，以及電鏡下觀察線粒體降解的超微結(jié)構(gòu)。然后，我們采用GFP-LC3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察LC3的表達(dá)水平。隨后，我們用WesternBlot檢測(cè)EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞里自噬相關(guān)蛋白Beclin-

12、1和LC3的表達(dá)情況。同時(shí)使用自噬抑制劑3-MA處理，觀察EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)引發(fā)的自噬現(xiàn)象能否被抑制。另外，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)EtBr處理肺癌細(xì)胞中Beclin-1和PINK1的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.低劑量EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)能逐步敲除肺癌細(xì)胞mtDNA
　　我們通過(guò)低劑量EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，能有效地逐步敲除肺癌細(xì)胞的線粒體DNA。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示肺癌細(xì)胞線粒體DNA的兩個(gè)標(biāo)志物在EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)后

13、顯著下降;顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)逐漸向長(zhǎng)梭形改變。同時(shí)EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)后肺癌細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)依賴(lài)性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)7天的肺癌細(xì)胞在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出增殖速度減慢，貼壁能力減弱，并逐漸漂浮死亡。因此，本文研究中使用的EtBr劑量能有效敲除肺癌細(xì)胞的線粒體DNA，需要補(bǔ)充外源性尿嘧啶維持細(xì)胞存活。
　　2.EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)顯著抑制肺癌細(xì)胞在體外、體內(nèi)的生長(zhǎng)
　　體外細(xì)胞增殖、克隆形成及遷移實(shí)驗(yàn)表明EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)導(dǎo)致

14、的肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移抑制與mtDNA缺失程度密切相關(guān)，即線粒體DNA缺失能影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，但是并不會(huì)明顯引發(fā)細(xì)胞早期凋亡事件。細(xì)胞周期檢測(cè)表明EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)引發(fā)細(xì)胞周期G0-G1期阻滯。肺癌異種移植模型顯示，EtBr預(yù)處理的肺癌細(xì)胞比對(duì)照組生長(zhǎng)明顯減慢，且與mtDNA缺失程度相關(guān)。另外，解剖后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)后肺癌細(xì)胞體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)率也明顯降低。
　　3.EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中線粒體發(fā)生降解

15、>　　LTR、MTG雙色熒光探針標(biāo)記的共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)肺癌細(xì)胞的LTR與MTG共定位細(xì)胞器結(jié)構(gòu)顯著多于對(duì)照細(xì)胞。我們?cè)诮?jīng)典的血清饑餓誘導(dǎo)培養(yǎng)模型中也觀察到相同的結(jié)果。但是與血清饑餓組細(xì)胞相比，EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)引發(fā)的LTR和MTG共定位結(jié)構(gòu)增多更顯著。而在電鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)后肺癌細(xì)胞中的線粒體數(shù)量逐漸減少，且與mtDNA的缺失程度相關(guān)。另外，TMRM共聚焦結(jié)果和JC-1流式細(xì)胞檢測(cè)均證實(shí)mtDNA逐

16、步缺失過(guò)程中線粒體的膜電位顯著下降。
　　4.EtBr誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞線粒體降解通過(guò)自噬途徑完成
　　在EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞中，觀察到MTG標(biāo)記的線粒體數(shù)量明顯減少而LTR結(jié)構(gòu)明顯增多，并且更多MTG標(biāo)記的線粒體移向LTR結(jié)構(gòu)中。此外，EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)肺癌細(xì)胞中GFP-LC3蛋白的表達(dá)明顯增多，且從細(xì)胞質(zhì)中的彌散分布向點(diǎn)狀聚集改變。WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明在線粒體降解過(guò)程中，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平明顯增加，此過(guò)程

17、能被自噬抑制劑3-MA抑制。同時(shí)，在EtBr誘導(dǎo)的線粒體降解過(guò)程中，Beclin-1蛋白的表達(dá)水平也有明顯增高，同樣能被3-MA抑制。而免疫熒光檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)EtBr處理肺癌細(xì)胞中Beclin-1和PINK1的表達(dá)水平較對(duì)照細(xì)胞顯著增高。
　　結(jié)論:
　　1.低劑量EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)可以有效敲除肺癌細(xì)胞的線粒體DNA，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間增加逐步出現(xiàn)對(duì)尿嘧啶的依賴(lài)性，且誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)后肺癌細(xì)胞的增殖、克隆

18、形成及遷移能力均減弱，且與mtDNA的缺失程度相關(guān);在體內(nèi)，經(jīng)EtBr預(yù)處理的肺癌細(xì)胞的腫瘤形成能力及生長(zhǎng)能力均減弱，同時(shí)EtBr誘導(dǎo)培養(yǎng)后肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能下降。
　　2.EtBr誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞mtDNA逐步缺失過(guò)程中伴隨線粒體的降解，表現(xiàn)為線粒體膜電位下降和線粒體數(shù)量減少。在線粒體的降解過(guò)程中，自噬信號(hào)通路被激活，該過(guò)程能被自噬抑制劑3-MA抑制，因此我們認(rèn)為自噬是溴化乙錠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞線粒體降解的機(jī)制之一，并可能受PI3K-Be