艱難梭菌細(xì)胞毒素B羧基末端功能區(qū)的克隆、表達(dá)及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：艱難梭菌(Clostridiumdifficiie)是造成抗生素相關(guān)性結(jié)腸炎及偽膜性結(jié)腸炎(PMC)的最常見致病菌。該菌造成老年人和免疫功能低下的病人抗生素相關(guān)性腹瀉及腸炎的發(fā)病率及死亡率明顯升高。Cdifficile產(chǎn)毒株準(zhǔn)確快速的診斷、鑒定，對確定病源、控制其傳播、有效治療患者是極其重要的。國外建立的酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測Cdifficile毒素，其優(yōu)點是靈敏度和特異度高，結(jié)果可在2-4小時內(nèi)得出，從而更適合指導(dǎo)臨

2、床實際工作，故被大力推廣，但國內(nèi)對艱難梭菌診斷試劑研究較少，尤其是對Cdifficile細(xì)胞毒素B(cdtB)的檢測。本課題利用cdtB特點，以基因工程技術(shù)對其羧基末端功能區(qū)進(jìn)行克隆、表達(dá)并純化出該蛋白，制備多克隆抗體，主要目的在于對該重組蛋白生物學(xué)特性進(jìn)行研究和探索，以期建立一種可快速、穩(wěn)定的檢測出Cdifficile細(xì)胞毒素B的ELISA診斷試劑。 方法：1、基因工程技術(shù)制備cdtB膜受體結(jié)合區(qū)域的重組蛋白。以Cdiffic

3、ile標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463的全長DNA序列為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼cdtB膜受體結(jié)合區(qū)域的功能基因，經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切后，定向插入同樣經(jīng)這兩種酶雙酶切的原核表達(dá)載體pET-22b(+)中，在DNAT4連接酶作用下進(jìn)行連接以獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)測序，結(jié)果與GenBank記錄的CdifficileVPI10463的cdtB羧基末端(bp5649-7496)基因序列相比對。將正確的重組子轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE

4、3)細(xì)菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出特異性蛋白，利用SDS-PAGE檢測重組蛋白。 2、親和色譜法純化重組蛋白并進(jìn)行WESTERN-BLOT分析。因表達(dá)載體pET-22b(+)具有His.Tag序列，故與固定化金屬離子(Ni2+)之間具有親合力，金屬螯合到固相支持物共價結(jié)合的反應(yīng)性基團(tuán)亞氨二乙酸(IDA)上，用咪唑?qū)⒅亟M蛋白洗脫下來，從而達(dá)到純化的目的。本研究選用NOVagen公司的His.Tag親合純化產(chǎn)品-His.Bind樹脂和

5、緩沖液試劑盒。純化后采用CoomassiebrilliantblueG-250比色法，以牛血清白蛋白(BSA，Sigma)為標(biāo)準(zhǔn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定重組蛋白濃度；并利用His.tag單克隆抗體與重組蛋白進(jìn)行WESTERN-BLOT分析。 3、多克隆抗體制備及其生物學(xué)特性的研究。以純化重組蛋白為抗原，免疫純種雄性新西蘭大白兔，在第4次加強(qiáng)免疫后第10天，制備多抗血清，利用雙向免疫擴(kuò)散法和間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法檢測抗體效

6、價，同時檢測重組蛋白和從NOVagen公司購得的Cdifficile細(xì)胞毒素B這兩種材料的抗原相關(guān)性。以重組蛋白與制備的多抗血清進(jìn)行WESTERN-BLOT分析以檢測抗體的特異性。用自制的多克隆抗體通過間接ELISA法對5株艱難梭菌產(chǎn)毒株、2株大腸桿菌、1株雙歧桿菌進(jìn)行艱難梭菌B毒素檢測。 結(jié)果：1、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼cdtB膜受體結(jié)合區(qū)域的功能基因為1848bp，經(jīng)測序與相應(yīng)Cdifficile標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463序列

7、區(qū)域的基因完全相同。目的基因與原核表達(dá)載體pET-22b(+)連接后獲得的重組質(zhì)粒，測序結(jié)果與GenBank記錄的CdifficileVPI10463的cdtB羧基末端(bp5649-7496)基因序列相比對符合率達(dá)99％。將經(jīng)鑒定的cdtBR陽性克隆子在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)，然后進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)的重組蛋白相對分子質(zhì)量為71300，與預(yù)期的蛋白大小一致。 2、根據(jù)金屬螯合親和色譜法在非變

8、性條件下純化重組蛋白，純化后的可溶性重組蛋白相對分子質(zhì)量為71300，有少許降解，純度達(dá)到90％。重組蛋白純化后根據(jù)CoomassiebrilliantblueG-250chromatometry比色法測出的蛋白濃度為0.762mg/ml。免疫印跡試驗說明重組蛋白與HisTag單克隆抗體可以發(fā)生特異性結(jié)合 3、獲得了相應(yīng)的多克隆抗血清，重組蛋白的抗原性是Cdifficile細(xì)胞毒素B抗原性的一部分。WESTERN-BLOT分析：

9、抗艱難梭菌B毒素膜受體結(jié)合蛋白多克隆抗體可以和重組蛋白cdtBR結(jié)合，與E.coli菌體裂解蛋白有非特異性的反應(yīng)。間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法測定抗體效價均為1：10000以上。自制多克隆抗體對8株臨床細(xì)菌進(jìn)行艱難梭菌B毒素檢測顯示，3株艱難梭菌產(chǎn)毒株、1株大腸桿菌為陽性結(jié)果，其余為陰性結(jié)果。 結(jié)論l、本研究參考Cdifficile國際標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463基因序列，用自行設(shè)計的CDB3引物在PCR反應(yīng)中表現(xiàn)出較高的特異

10、性，為理想的引物序列。蛋白電泳分析表明獲得了高效表達(dá)的CdifficileToxinB3克隆株。 2、本研究利用基因工程得到的重組蛋白，western-blot證實表達(dá)的蛋白與本研究所設(shè)計相一致。為進(jìn)一步研究CDAD的診斷試劑和免疫保護(hù)作用奠定了重要的實驗基礎(chǔ)。 3、通過動物實驗本研究發(fā)現(xiàn)，重組蛋白具有良好的免疫原性，該多克隆抗體具有良好的生物學(xué)活性、較好的特異性。但因為是多克隆抗體，故特異性不高，需要更深入地研究此重組