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文檔簡介
1、A D i s s e r t a t i o nS u b m i t t e d i nP a r t i a lF u l f i l l m e n t o f t h eR e q u i r e m e n t sf o rt h eD e g r e e o f M a s t e r i nE n g i n e e r i n gC l o n i n g o f E n d o g l u c a n a s e E
2、 G I V f r o mZ v i r e n sZ Y - 0 1a n d o v e r e x p r e s s i o n i nE c o l iM a s t e r C a n d i d a t e :M a j o r :S u p e r v i s o r :Q i a oH uC h e m i c a l E n g i n e e r i n g a n d T e c h n o l o g yP
3、r o f .Z h o n g h u a Y a n gW u h a n U n i v e r s i t y o fS c i e n c ea n d T e c h n o l o g yW u h a n ,H u b e i 4 3 0 0 8 1 ,P .R .C h i n aM a y , 2 0 1 6摘要纖維素酶是水解纖維素及其衍生物等多糖生成單糖的一類酶的總稱,能夠解決自然界中纖維素類物質燃燒造成的資源浪費
4、和環(huán)境污染的問題。內切葡聚糖酶作為纖維素酶的重要功能成分,在纖維素酶降解纖維素的過程中扮演著重要的角色??寺惹衅暇厶敲富虿崿F異源高效表達,有助于了解內切葡聚糖酶的降解特性,從而提高纖維素酶降解纖維素的能力。對此,本論文從綠木霉Z v i r e n sZ Y - 0 1 中克隆得到內切葡聚糖酶E G I V 基因,并對其進行異源表達,進一步對目的蛋白進行純化,研究其酶學特性,為提高纖維素酶的酶活,實現高效降解纖維素及高效生產提供基
5、礎。首先,提取綠木霉z v i r e n sZ Y - 0 1 的R N A ,利用R T - P C R 的方法克隆得到內切葡聚糖酶E G I V 的基因,將其連接至可溶性表達載體p E T - 3 2 a 上,并將其轉化至E .c o l i D H 5 e t 。利用菌落P C R 和質粒雙酶切驗證重組質粒p E T 3 2 a .E G I V ,對鑒定正確的重組質粒進行測序,測序結果顯示,目的基因E G I V 的開放閱讀框
6、為1 0 6 9b p ,編碼3 5 6 個氨基酸,與T r i c h o d e r m a v i r i d e A S3 .3 7 1 1 菌株相比,核酸序列同源性高達9 5 .2 %,氨基酸的同源性高達1 0 0 %。為了檢測目的基因的表達情況,通過熱激法將重組質粒轉化至表達宿主細胞B L 2 1 ( D E 3 ) 中,含有T 7 啟動子的重組質粒在I P T G 的誘導下,能高效表達目的蛋白。對誘導液進行破胞,并對破胞后
7、的粗酶液進行親和層析鎳柱純化,S D S - P A G E分析破胞前后的上清和沉淀,測量酶液純化前后的酶活和蛋白含量,從而計算比酶活。S D S .P A G E 結果顯示重組蛋白是胞內酶且可溶,目的蛋白的分子量約為3 9k D a ,重組葡聚糖內切酶E G I V 的粗酶液的比酶活為0 .9 3 U /m g ,親和層析純化之后,比酶活提高到6 .0 4 U /m g ,純化了6 .5 倍。為了進一步實現內切葡聚糖酶在反應的過程中酶
8、解能力達到最大,分別測量重組酶在不同條件下降解羧甲基纖維素鈉的能力,對重組葡聚糖內切酶的動力學參數,最適反應溫度、最適反應p H ,酶的熱穩(wěn)定性、p H 穩(wěn)定性等進行研究。結果顯示,重組內切葡聚糖酶的K m = 1 3 .7 1 m g /m L ,V 。。= O .5 lg m o l /m i n ,其最適反應溫度和p H 分別為4 5 ℃和p H 7 .4 ,重組內切葡聚糖酶在2 0 - 5 0 ℃以及p H = 5 - 8的范圍
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