牦牛瘤胃木聚糖酶基因簇中基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、瘤胃是自然界中降解纖維素能力最強(qiáng)的優(yōu)良的生物系統(tǒng)之一[1]。這一環(huán)境中的微生物為我們開發(fā)新基因和酶提供了巨大的資源，因此也成為開發(fā)利用生物質(zhì)能源的研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的研究手段是依賴從瘤胃中分離培養(yǎng)而獲得木質(zhì)纖維素降解菌。根據(jù)微生物計(jì)數(shù)的研究，瘤胃中有75％的原核生物是未培養(yǎng)微生物。因此，未培養(yǎng)微生物可能在瘤胃中降解木聚糖的過程中起著非常重要的作用[2]?；蚪M/元基因組技術(shù)是一種獨(dú)立于純培養(yǎng)的微生物群體基因組學(xué)的分析工具，通過構(gòu)建牦牛瘤胃未

2、培養(yǎng)細(xì)菌的宏基因組文庫，直接從中發(fā)現(xiàn)大量木質(zhì)纖維素降解酶的基因/基因簇，從分子水平上研究其降解木質(zhì)纖維素的機(jī)理，為瘤胃微生物資源的開發(fā)提供有力的保障。
　　本研究從本實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建好的牦牛瘤胃元基因組BAC文庫9600個(gè)克隆中篩選木質(zhì)纖維素降解酶基因/基因簇，獲得了121個(gè)（1.26%）木聚糖酶陽性克隆，結(jié)合其他酶活共得到293個(gè)（3.05%）陽性克隆。對(duì)這些克隆采用454測(cè)序后，對(duì)其中的木聚糖酶和木糖苷酶等木聚糖降解相關(guān)酶進(jìn)行

3、分析，與 GenBank的蛋白數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫以及COG數(shù)據(jù)庫比對(duì)，結(jié)合Pfam的分析結(jié)果和碳水化合物活性酶分析網(wǎng)站 CAZy(http://www.cazy.org)的信息，篩選其中編碼木聚糖酶的相關(guān)基因。從篩選到的未培養(yǎng)微生物木聚糖酶中克隆和表達(dá)了一個(gè)可能的木聚糖降解基因簇中的相關(guān)基因。對(duì)它們的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，這些酶的最適反應(yīng)溫度都是40℃，最適反應(yīng)pH值都是6，這與它們所在的瘤胃環(huán)境酶促反應(yīng)條件是一致的。通過體外實(shí)驗(yàn)研究