17900.木霉內(nèi)切葡聚糖酶定向進(jìn)化及高活性突變體的篩選

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：時(shí)間：加／今年易月鄉(xiāng)日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校

2、有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：第一導(dǎo)師簽名：豳墊時(shí)間：洳，≯年6月7日時(shí)間：加f2年6月7日摘要lIll1IIIIIIIIIIIIIIllIY2149631纖維素是自然界中數(shù)量最大的可再生性資源，它的降解依賴于纖維素酶系，包括外切葡聚

3、糖酶(I!G)、內(nèi)切葡聚糖酶(CBH)和B葡萄糖苷酶的協(xié)同作用。內(nèi)切葡聚糖酶EGI是纖維素酶系中的主要組份，由催化結(jié)構(gòu)域、連接肽和結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，但目前報(bào)道的酶活性較低，限制了工業(yè)應(yīng)用。本研究以里氏木霉(Trichodermareesei)、擬康氏木霉(Hpseudokoningii)和長枝木霉(T10ngibrachiatum)EGI基因?yàn)槟０澹ㄟ^DNA改組技術(shù)構(gòu)建突變體庫，并對酵母重組分泌的表達(dá)突變體篩選，主要結(jié)果如下：1分別克隆

4、了里氏木霉，擬康氏木霉和長枝木霉內(nèi)切葡聚糖酶編碼EGI的基因組DNA，其基因全長分別是1507bp，1566bp和1566bp，根據(jù)報(bào)道，它們均由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，分別編碼459，461和461個(gè)氨基酸，編碼蛋白的N端均為22aa組成的信號肽。2采用重疊PCR法獲得里氏木霉無內(nèi)含子的內(nèi)切葡聚糖酶基因egl，將去除信號肽的編碼序列插入pYEa酵母表達(dá)載體，表達(dá)的蛋白含有分泌信號肽a；以構(gòu)建含自身信號肽重組表達(dá)載體作對照。分別轉(zhuǎn)化

5、釀酒酵母，誘導(dǎo)后檢測到，表達(dá)含a信號肽的內(nèi)切葡聚糖酶的重組細(xì)胞有活性；而對照無明顯活性。說明a信號肽可有效地將EGI成熟肽分泌至胞外。3采用重疊PCR法分別獲得擬康氏木霉和長枝木霉內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因，構(gòu)建酵母分泌表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母，重組轉(zhuǎn)化子檢測到酶活。4對3種木霉成熟肽編碼序列進(jìn)行DNA改組，構(gòu)建突變體庫，通過活性篩選獲得高活性突變體，命名為New8。它在誘導(dǎo)培養(yǎng)96h達(dá)到活性最高197U／mL，是3種木霉的野生型EGI平均

6、酶活的19倍；最適溫度為50。C，最適pH為56，與其他3種木霉相似。SDSPAGE電泳顯示New8亞基蛋白分子量比理論分子量偏大。5亞克隆New8egl，由1320bp組成，核苷酸序列分析表明與里氏木霉，擬康氏木霉和長枝木霉的相似度分別為94％，95％，96％，有114個(gè)重組位點(diǎn)和4個(gè)突變位點(diǎn)。New8EGI與3個(gè)原始EGI之間的同源性為95％，96％，97％。在4個(gè)突變位點(diǎn)中，V10A和F192L未引起New8EGI疏水性改變，G1

7、00S和S318G引起親水性改變。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)：果表明，突變位點(diǎn)$318G在催化結(jié)構(gòu)域的活性中心附近。綜上所述，本文克隆了里氏木霉，擬康氏木霉和長枝木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因egl；建立了木霉EGI釀酒酵母胞外分泌表達(dá)體系；并將這一體系運(yùn)用于木霉egl多基因改組酵母文庫的初步構(gòu)建及篩選；獲得一內(nèi)切葡聚糖酶新基因。這一研究將為今后纖維素酶系中其它酶類(CBH、BG)的基因改造，乃至構(gòu)筑高效的纖維素降解體系奠定良好的前期基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：內(nèi)切