2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本試驗采用RT-PCR法以黑曲霉(Aspergillus niger)菌株總:RNA為模板克隆內(nèi)切葡聚糖酶基因cDNA序列。PCR產(chǎn)物直接測序表明EG-B基因全長999bp,GC堿基含量為53.95%,以ATG為起始密碼子,TGA為終止密碼子,編碼332個氨基酸組成的多肽,與參考內(nèi)切葡聚糖酶Eng1基因(Genebank NO.AF331518)核苷酸同源性為98%,氨基酸同源性為99%。。氨基酸序列分析表明該內(nèi)切葡聚糖酶屬于糖基水解酶

2、家族5。將該基因擴增至pMD19-T simple載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中,構(gòu)建重組質(zhì)粒CTB256-T-1和CTB256-T-2。其中CTB256-T-2 PCR擴增出的目的基因成熟編碼區(qū)與PCR產(chǎn)物直接測序結(jié)果完全一致。 在上述試驗的基礎(chǔ)上,通過限制性內(nèi)切酶EcoR I/HindⅢ完成了原核表達(dá)載體構(gòu)建:將經(jīng)雙酶切鑒定正確的原核融合表達(dá)質(zhì)粒pET-28a/EG-B在大腸桿菌BL21(DE3)中充分表達(dá);并利用原核表

3、達(dá)載體pET-28a上N端融合組氨酸標(biāo)簽,將EG-B基因表達(dá)的目的蛋白經(jīng)Ni<'2+>-chelating和Heparin樹脂逐級分離純化:純化后的目的蛋白作抗原免疫家兔,制備多克隆抗體,Western blotting檢測確定EG-B基因表達(dá)的重組蛋白和黑曲霉(Aspergillus niger)菌株天然蛋白具有相同的抗原顯色反應(yīng)。試驗結(jié)果如下:(1)RT-PCR法克隆的EG-B基因與已發(fā)表黑曲霉(Aspergillus niger)

4、編碼內(nèi)切葡聚糖酶Eng1基因(Genebank NO.AF331518)核苷酸同源性為98%,氨基酸同源性為99%;(2)EG-B基因表達(dá)的目的蛋白相對分子質(zhì)量為36.52KDa,蛋白的等電點為4.115; (3)EG-B基因表達(dá)的目的蛋白經(jīng)多級分離純化后酶比活力為180.8U/mg;(4)EG-B基因表達(dá)的重組蛋白和黑曲霉(dspergillus niger)菌株天然蛋白具有相同的抗原顯色反應(yīng)。以上試驗結(jié)果可以得到同一個結(jié)論,即編碼黑

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