中國牦牛瘤胃微生物來源的雙功能木聚糖酶-內(nèi)切葡聚糖酶的克隆及功能研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是自然界中儲量最豐富的可再生資源,是21世紀解決環(huán)境污染、食品短缺、能源危機的有效途徑,而生物能源的技術(shù)瓶頸則是纖維素酶。為尋找新型、高效的木質(zhì)纖維素酶,本研究利用宏基因組技術(shù),對中國牦牛瘤胃微生物纖維素降解酶基因資源進行了研究。在本研究中,通過對中國牦牛瘤胃宏基因組cosmid文庫的活性篩選,獲得能夠水解羧甲基纖維素鈉(CMC)的陽性克隆,進一步通過構(gòu)建亞克隆、測序、同源比對的方法獲得內(nèi)切葡聚糖酶基因RuCelA的cds序列

2、,該基因編碼區(qū)長1656bp,編碼了551個氨基酸,分子量約60kD,隸屬于纖維素水解酶家族5。利用大腸桿菌表達獲得重組蛋白RuCelA,并對其進行了酶學(xué)屬性的研究。以CMC為底物時,其內(nèi)切葡聚糖酶活性在50℃、pH=5.0時酶的活性最高;而以木聚糖為底物時,其木聚糖酶活性在65℃、pH=7.0時活性達到最大。Co+、Co2+可以明顯提高RuCelA內(nèi)切葡聚糖酶活性,卻抑制木聚糖酶活性。通過對大麥葡聚糖、木聚糖等底物的非完全水解產(chǎn)物按時

3、取樣進行TLC分析,證實了RuCelA內(nèi)切葡聚糖酶及木聚糖酶的水解模式均為內(nèi)切模式,通過對完全水解產(chǎn)物的TLC及HPAEC分析發(fā)現(xiàn)二糖、三糖、四糖為主要水解產(chǎn)物,伴隨有少量單糖。RuCelA可以水解糖類的最小聚合度為三糖。在底物特異性研究中發(fā)現(xiàn),RuCelA對濾紙有一定的水解活性,RuCelA對含有β-1,3/4糖苷鍵的大麥葡聚糖及地衣多糖底物有非常高的降解能力,對含有β-1,4糖苷鍵的底物如木聚糖、羥乙基纖維素、CMC等底物具有一定的

4、降解能力,而對不含β-1,4糖苷鍵的底物,如只含β3-1,3糖苷鍵的葡聚糖及含β-1,3/6糖苷鍵的海藻多糖,并無降解能力。RuCelA可以與葡萄糖苷酶及木糖苷酶在對大麥葡聚糖及木聚糖的水解過程中表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。此外,利用雙功能RuCelA可以在45℃實現(xiàn)對堿預(yù)處理的木質(zhì)纖維素長達14天的單酶降解,得到的還原糖濃度要高于同酶活水平下的單功能酶,并與單功能酶混合使用時得到的還原糖濃度基本持平。這說明,雙功能酶RuCelA可以作為兩種