J亞群禽白血病病毒gp37基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及體外干擾效應(yīng)的初步研究.pdf

1、本研究以禽白血病病毒J亞群(ALV-J)gp37基因?yàn)榘邢蚧颍訰NA干擾的方法，干擾其表達(dá)，以達(dá)到限制ALV-J在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的目的。 參照Takara和Ambion公司的成功的經(jīng)驗(yàn)并利用Ambion公司的在線設(shè)計(jì)工具h(yuǎn)tt:www.ambion.com/techlib/misc/siRNAdesignhtml，針對(duì)ALV-JNX0101株gp37基因序列(編碼跨膜蛋白TM)尋找siRNA靶序列，根據(jù)siRNA陰性對(duì)照設(shè)計(jì)原則

2、設(shè)計(jì)相應(yīng)的陰性對(duì)照。經(jīng)BLAST驗(yàn)證，所選擇的靶序列與雞體和其它病毒基因片段無同源性。在設(shè)計(jì)的靶序列5’端開始的19個(gè)核苷酸為正義鏈，中間加入9個(gè)核苷酸TTCAAGAGA間隔以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3’端加有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)TTTTTT。并且5’端帶有BamHI(GATCC)酶切位點(diǎn)，3’端帶有XhoI(CTCGAG)和HindⅢ(TTCGA)酶切位點(diǎn)。靶序列分別被克隆到psilencer2.1-U6載體上。經(jīng)XhoI酶切鑒定和測序鑒定后，證明已成

3、功地構(gòu)建了針對(duì)gp37基因不同區(qū)域的siRNA(smallinterferingRNA)表達(dá)載體。分別命名為pu6gp37-1，pu6gp37-2，pu6gp37-3，pu6gp37-4，pu6gp37-5，pu6gp37-6，pu6gp(陰性對(duì)照)。 以提取的ALV-JNX0101株病毒基因組DNA為模板，根據(jù)GeneBank上發(fā)表的ALV-JNX0101株gp37基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增出gp37(591bp)

4、基因，克隆到pMD18-TVector。目的片段經(jīng)雙酶切連接到pEGFP-N1載體上，經(jīng)酶切和測序鑒定后，證明已成功地構(gòu)建了gp37基因的融合表達(dá)載體，命名為pEGFP-gp37。 用pEGFP.gp37融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后24h，48h，72h觀察熒光的變化。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后24h就可見到熒光，48h熒光最強(qiáng)，72h熒光逐漸減弱，減少；pEGFP-gp37與構(gòu)建的針對(duì)gp37基因不同區(qū)域的siRNA表達(dá)載體分別兩