選擇壓作用下J亞群禽白血病病毒突變位點的研究.pdf

1、禽白血病病毒(ALV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬禽反轉(zhuǎn)錄病毒，引起禽造血組織中某些細胞成分的腫瘤性增生。而主要引起髓細胞性白血病的ALV-J是目前廣為流行的一個亞群，自1988年Payne首次從肉雞中分離出此病毒后，該病現(xiàn)已呈世界性分布。我國于1999和2004年分別從肉雞和蛋雞中分離出該病毒，此后陸續(xù)有地方品種雞感染此病的報道。ALV-J自我國出現(xiàn)以來，其感染宿主范圍不斷擴大，但其還沒有突破種間屏障而感染與雞親緣性關系更遠的品種

2、，如雉，鵪鶉等。
　　本研究建立了3種選擇壓模型，體外實驗通過選擇抑制物疊氮胸苷(AZT)，在DF-1細胞上干擾ALV-J NX0101株的復制，對病毒連續(xù)傳代后觀察病毒在AZT作用下囊膜基因的突變情況。體外宿主細胞之間的依次過渡，觀察病毒在不同宿主細胞作用下囊膜基因突變情況。體內(nèi)實驗通過人工模擬自然感染ALV-JNX0101株，將ALV-J依次人工感染易感宿主禽（SPF雞，火雞），然后過渡到抗性宿主禽（鵪鶉，山雞，鴨），觀察宿主

3、禽病理變化，分析感染后宿主禽排毒規(guī)律及分離株囊膜基因遺傳進化規(guī)律，解析不同宿主禽的過渡后ALV-J NX0101株的跨種傳播機制。
　　結果顯示，藥物選擇壓作用下對病毒的連續(xù)傳代，使藥物不會對病毒的糖基化位點造成改變。P2-TEF與P0-NX0101株序列相近，說明體外細胞培養(yǎng)體系選擇作用單一，對病毒作用效果不明顯。
　　通過對體內(nèi)選擇壓模型的建立，實現(xiàn)了對抗性宿主山雞和鵪鶉的感染，但是沒有實現(xiàn)鴨的跨宿主傳播。通過不同宿主泄

4、殖腔棉拭子p27蛋白的實時監(jiān)測，觀察到1日齡禽苗腹腔感染宿主山雞，排毒時間延后，毒力降低，山雞感染率37.5％。禽胚感染宿主，出殼后即可排毒，SPF和火雞毒力較強，感染率分別為57％和100％，抗性宿主鵪鶉感染率為11％，而鴨未感染。5種宿主在剖殺日齡時均未產(chǎn)生抗體，感染宿主呈現(xiàn)V+A-的免疫耐受狀態(tài)。病理組織學觀察均可見肝臟，脾臟及心血管系統(tǒng)損傷。
　　體內(nèi)選擇壓模型env基因序列分析，由NS/S得，P1-SPF，P2-Turk

5、ey，P3-Pheasant，P4-Quail與P0-NX0101株gp85基因NS/S分別為0.39，1.27，1.33，1.26;hr2區(qū)域的NS/S分別為0，1.67，2.5，2.5。由NS/S≥2.5指出，hr2區(qū)域是決定宿主范圍的關鍵區(qū)域，提示我們ALV-J的跨種傳播與該區(qū)域突變密切相關。而P2-Turkey，P3-Pheasant，P4-Quail與HPRS-103株處于同一分支，可以推斷病毒基因序列向HPRS-103株發(fā)生

6、回歸突變。
　　通過糖基化位點比較:P0-NX0101，P1-P4宿主禽分離株在81-83位均比NX0101-NCBI株多出一個糖基化位點。它的出現(xiàn)使病毒發(fā)生免疫逃逸，病毒中和抗體應答減弱造成中和抗體應答反應減弱。保守的糖基化位點，與抗原表位，毒力或致病性密切相關。NX0101-NCBI，P0-NX0101，P1-SPF株與HPRS-103株遺傳突變關鍵點是V131F，L195F; P0，P1-SPF與NX0101-NCBI株遺傳

7、突變關鍵點是L144F，S121R，它們都位于hr1或hr2區(qū)域，通過苯環(huán)和糖基化位點的插入與缺失，易導致病毒毒力，致病性和免疫逃逸的改變。P2，3，4宿主禽分離株向HPRS-103株回歸，194 D-N-D使糖基化作用缺失，195 L-F-L使苯環(huán)結構消失，氨基酸的回歸改變病毒毒力，揭示其是P2，3，4宿主毒與P1宿主毒毒力不同的關鍵位點。P2-Turkey株特殊位點為Y191C，P3-Pheasant株特殊點為C75R，氨基酸的改變