SYBRGreenⅠ熒光定量RT-PCR檢測J亞群禽白血病病毒方法的建立及應用.pdf

1、J亞群禽白血病((Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)是由J亞群禽白血病病毒引起的雞骨髓樣細胞瘤以及其它腫瘤性性疾病。1999年,我國首次由杜巖等在肉雞的商品代中分離了ALV-J。J亞群禽白血病在我國呈現了不斷發(fā)展的態(tài)勢,宿主范圍已從肉用型雞向蛋雞和地方雞種蔓延,病雞的生產性能降低,死亡率明顯升高,給我國養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經濟損失。因此,建立快速、特異和敏感的ALV-J檢測方法具有重要的實際意義。<

2、br>　　為建立SYBRGreenⅠ熒光定量PCR檢測ALV-J的方法,本研究以ALV-J原型毒株HPRS-103基因組中pol基因3’端和gp85基因之間的保守區(qū)域作為檢測靶基因片段,構建其重組質粒作為陽性標準品,通過對模板濃度、引物濃度和退火溫度的優(yōu)化,建立了ALV-JSYBRGreenⅠ熒光定量PCR方法。結果顯示該方法的最低檢測限度為2.36×103DNA分子/μL,較普通PCR提高100倍;可特異性擴增出545bp的ALV-J

3、目的基因,而對其他禽源病毒無交叉反應;批內變異系數為0.17~2.43％,批間變異系數2.73~3.68%,均小于5%。表明所建立的方法較高的靈敏性、很強的特異性、好的重復性和穩(wěn)定性。
　　根據所建立的熒光定量RT-PCR方法對臨床樣品和市售禽類疫苗進行檢測。在所檢測的12種不同禽類疫苗中均未檢測到ALV-J,表明所檢測的市售禽類弱毒苗中無ALV-J污染。在所檢測的4個品種125只臨床疑似病雞中ALV-J陽性檢出率為46.40%(

4、58/125),其中嶺南黃肉雞、淮南麻黃雞、地方雞種和京紅1號蛋雞的陽性檢出率分別為65.31%(32/49)、55.26%(21/38)、31.25%(5/16)和0%(0/22),表明不同品種的雞對ALV-J的易感性不同。
　　選擇10只27周齡陽性感染期嶺南黃肉雞,應用熒光定量RT-PCR方法檢測不同臟器中ALV-J的分布及其mRNA表達水平。結果發(fā)現在心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中均能檢測到病毒基因,多重比較檢驗分析顯示腎