禽白血病病毒B、E和J亞群基因芯片檢測(cè)方法的建立.pdf

1、近年來(lái)雞淋巴白血病(AL)一直危害著我國(guó)的養(yǎng)雞業(yè),已成為影響我國(guó)蛋雞業(yè)的第一大疫病。由于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,進(jìn)口ELISA試劑盒價(jià)格高昂且準(zhǔn)確率并不理想,所以急需一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)方法來(lái)預(yù)防和控制AL發(fā)生和傳播。本研究基于多重PCR技術(shù),建立禽白血病病毒(ALV)的B、E、J亞群的基因芯片分型和檢測(cè)方法。
　　 根據(jù)NCBI已收錄的ALV三個(gè)亞群的參考毒株cDNA序列,在各亞群特異性基因突變區(qū),兩端選取其

2、保守區(qū)域,設(shè)計(jì)合成三個(gè)亞群的通用上游引物1條,以及B、E亞群的通用下游引物和J亞群下游引物各l條,將上述引物用Cy3標(biāo)記,建立多重PCR體系;參考目的序列內(nèi)部的三個(gè)亞群各自的保守區(qū)域,選擇亞群之間基因突變位點(diǎn)多的區(qū)域,設(shè)計(jì)5條寡核苷酸探針,合成過(guò)程中在每條探針的5'端先加入若干個(gè)堿基T,使探針長(zhǎng)度達(dá)到35mer左右,再進(jìn)行氨基化修飾,將合成好的探針點(diǎn)制在醛基化玻璃基片上,制作寡核苷酸探針基因檢測(cè)芯片;以寄主細(xì)胞DF-1中提取傳代ALV的

3、cDNA,以及合成NCBI收錄的各亞群參考毒株的cDNA序列作為檢測(cè)模板,利用Cy3標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,與基因芯片進(jìn)行雜交反應(yīng),掃描結(jié)果。對(duì)基因芯片進(jìn)行特異性、靈敏度實(shí)驗(yàn),并對(duì)50份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。
　　 經(jīng)雜交反應(yīng)后,芯片能夠準(zhǔn)確檢測(cè)并分型三個(gè)亞群的參考毒株,其檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到102個(gè)基因拷貝,能夠同時(shí)檢測(cè)到三個(gè)亞群參考毒株的多重PCR產(chǎn)物,且與禽類(lèi)常見(jiàn)的四種病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。對(duì)臨床樣品檢測(cè)的結(jié)果與ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果