禽β-防御素6(AvBD6)組織定位及抗J亞群禽白血病病毒活性研究.pdf

1、近年來(lái)，隨著家禽集約化飼養(yǎng)、高密度飼養(yǎng)等造成全球腫瘤性免疫抑制疫病的爆發(fā)，例如ALV-J、MDV、REV等。J亞群禽白血病主要引起以髓細(xì)胞瘤和其他細(xì)胞惡性腫瘤增生為特征的傳染性腫瘤性疾病。自我國(guó)出現(xiàn)ALV-J以來(lái)，其感染宿主范圍不斷擴(kuò)大，發(fā)病日齡逐漸提前，導(dǎo)致的腫瘤類型不斷增多，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)于ALV-J尚無(wú)有效的預(yù)防和治療手段，因此尋求一種能有效抑制ALV-J病毒的細(xì)胞內(nèi)防御蛋白是必要的。
　　禽β-防御素

2、(AvBD)是一類廣泛存在于禽體內(nèi)的宿主防御蛋白，主要特征結(jié)構(gòu)是含有6個(gè)半胱氨酸殘基構(gòu)成的3對(duì)二硫鍵，是機(jī)體防御微生物入侵體內(nèi)的第一道屏障。具有廣譜抗菌、抗病毒、抗真菌的生物學(xué)作用，在禽類的先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。
　　為進(jìn)一步研究雞AvBD的組織分布及抗病毒作用，本研究運(yùn)用PCR方法，從SPF雞的肝臟組織中擴(kuò)增到雞AvBD6基因。將測(cè)序結(jié)果與已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)禽β-防御素和不同種屬禽β-防御素的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析、繪制分子

3、遺傳進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，AvBD6基因前體肽由67個(gè)氨基酸殘基組成，其cDNA全長(zhǎng)為204bp，含有6個(gè)穩(wěn)定的半胱氨酸，分別以1-5、2-4、3-6連接形成3個(gè)分子的二硫鍵，構(gòu)成穩(wěn)定的反相平行的3股β-片層結(jié)構(gòu)C-X4-8-C-X3-5-C-X9-13-C-X4-7-C-C，與雞AvBD7氨基酸同源性最高為62.7％。
　　將雞AvBD6基因亞克隆到表達(dá)載體pGEX-6p-1上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-AvBD6，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到

4、Rosseta(ER2566)感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)雞AvBD6融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。將雞AvBD6重組蛋白進(jìn)行包涵體純化，再免疫新西蘭大白兔，制備其多克隆抗體，經(jīng)ELISA測(cè)定雞AvBD6融合蛋白多克隆抗體效價(jià)為1∶211。用自制的多克隆抗體建立特異性檢測(cè)雞AvBD6分布免疫組化方法，對(duì)SPF雞組織器官中AvBD6進(jìn)行檢測(cè)分析，在骨髓的髓系細(xì)胞、肺的呼吸毛細(xì)管上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、十二指腸的腸絨毛上皮細(xì)胞等分

5、布較多。運(yùn)用建立的雞AvBD6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)雞AvBD6組織表達(dá)差異、不同日齡SPF雞的AvBD6動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律研究，發(fā)現(xiàn):AvBD6在骨髓中表達(dá)極高，在肺、腎、肝、脾組織器官的表達(dá)量相對(duì)較高，其它各組織器官均有不同程度的表達(dá);隨著日齡的增長(zhǎng)AvBD6呈現(xiàn)“波浪”形規(guī)律。
　　為了明確AvBD6是否具有抗ALV-J作用，運(yùn)用蛋白透析復(fù)性法，獲得具有天然結(jié)構(gòu)的AvBD6重組蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，AvBD6重組蛋白具有良好的抑制