RNA干擾J亞群禽白血病病毒跨膜蛋白(TM)表達(dá)對(duì)病毒復(fù)制的影響.pdf

1、禽白血病(avian leukosis，AL)是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬禽白血病病毒引起的以禽類造血組織中某些細(xì)胞成分過(guò)度增生為主的一類可傳染的腫瘤性疾病，可劃分為A-J10個(gè)亞群，其中禽白血病J亞群病毒(ALV-J)是由內(nèi)源性和外源性ALV重組而來(lái)，自發(fā)現(xiàn)以來(lái)給養(yǎng)禽造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。至目前為止，無(wú)任何可預(yù)防和治療的藥物。為減輕該病毒對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害，探索合適的預(yù)防和治療方法成為生產(chǎn)上亟待解決的問(wèn)題。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄病毒入侵細(xì)胞采用

2、膜融合機(jī)制這一特點(diǎn)，本研究采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，特異地阻斷膜融合的關(guān)鍵基因表達(dá)沉默，以切斷病毒入侵宿主細(xì)胞途徑，達(dá)到抗病毒目的。ALV-J與受體結(jié)合后通過(guò)gp37基因編碼的跨膜蛋白(TM)構(gòu)象的變化實(shí)現(xiàn)膜融合過(guò)程，因此我們以gp37為靶向基因設(shè)計(jì)合成6對(duì)短的雙鏈RNA(siRNA)，克隆到psilence2.1-U6載體上命名為pu6gp37-1，pu6gp37-2，pu6gp37-3，pu6gp37-4，pu6gp37-5，

3、pu6gp37-6，pu6gp(陰性對(duì)照)。分別在CEF及1日齡SPF雛雞上進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)對(duì)病毒復(fù)制的影響。結(jié)果顯示siRNA無(wú)論在體內(nèi)還是體外，對(duì)ALV-J的增殖都起到了抑制作用。這為抗ALV-JsiRNA藥物的臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并為其它病毒病的防治提供了可借鑒的方法。 pEGFP-N1真核細(xì)胞表達(dá)載體攜帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因，將攜帶gp37基因的pEGFP-gp37融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CEF，分別在24h，48h

4、，72h觀察熒光的變化。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后24h就可見到熒光，48h熒光最強(qiáng)，隨后逐漸減弱；將pEGFP-gp37與構(gòu)建的針對(duì)gp37基因不同區(qū)域的siRNA表達(dá)載體分別兩兩共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞48h后觀察，可見與pu6gp37-2、pu6gp37-4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組熒光減弱且熒光細(xì)胞數(shù)減少，初步驗(yàn)證pu6gp37-2、pu6gp37-4抑制了gp37基因在CEF中的表達(dá)。將pu6gp37-2、pu6gp37-4、pu6gp轉(zhuǎn)染CEF，8h后接入ALV

5、-J NX0101毒株，5d后用間接免疫熒光檢查細(xì)胞感染狀況，熒光顯微鏡下可見pu6gp37-2、與pu6gp組熒光細(xì)胞數(shù)及強(qiáng)度相近，而pu6gp37-4組明顯減少減弱，說(shuō)明該組病毒增殖受到抑制。pu6gp37-4干擾作用的發(fā)揮與其序列位置有關(guān)，它列位于膜外區(qū)與免疫抑制區(qū)緊緊相連，此段序列的沉默不僅可以抑制病毒與宿主細(xì)胞的融合，也會(huì)減輕病毒感染所產(chǎn)生的免疫抑制。 體內(nèi)試驗(yàn)共設(shè)置治療組(先接毒后注射siRNA)和預(yù)防組(先注射si

6、RNA后接毒)兩大方向組，組內(nèi)根據(jù)接種劑量和途徑又分為高劑量、低劑量及連續(xù)注射siRNA組，連同陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組，本實(shí)驗(yàn)共分為8個(gè)試驗(yàn)組。1日齡接種后，每周剖檢1次，共進(jìn)行4次。通過(guò)對(duì)體重、免疫器官重量、血液學(xué)指標(biāo)(抗原、抗體、血液細(xì)胞數(shù))、胸腺CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞變化及病原的連續(xù)檢測(cè)以檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)RNAi ALV-J復(fù)制的作用。對(duì)4次剖檢樣品的血清進(jìn)行ALV-J抗體檢測(cè)全部為陰性，說(shuō)明雞群均處于病毒血癥狀態(tài)，對(duì)后2次剖檢

7、樣品棉拭子進(jìn)行ALV-J抗原p27檢測(cè)，所有攻毒雞群抗原均呈現(xiàn)陽(yáng)性，且先攻毒組的OD值要大于后攻毒組，證明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒ⅰ?duì)其他各項(xiàng)指標(biāo)的4次檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析可以看出，預(yù)防低劑量組可以有效地緩解病毒對(duì)體重、胸腺、脾臟、法氏囊發(fā)育的抑制，5周齡時(shí)其重量分別為陽(yáng)性對(duì)照組的1.5倍、6.7倍、6.5倍、1.9倍。治療組保護(hù)作用沒有預(yù)防組顯著。用流式細(xì)胞儀對(duì)該組T淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果為，CD4+T淋巴細(xì)胞高于陽(yáng)性對(duì)照組并接近陰性對(duì)照組數(shù)值，

8、說(shuō)明病毒對(duì)免疫器官?zèng)]有造成太大損傷。血細(xì)胞分析儀對(duì)白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)的分析同樣顯示了小劑量siRNA在干擾病毒復(fù)制上的優(yōu)勢(shì)，白細(xì)胞數(shù)，淋巴細(xì)胞數(shù)均接近正常值。通過(guò)石蠟切片觀察可知，陽(yáng)性對(duì)照組在腎臟、肝臟、脾臟等器官都出現(xiàn)淋巴細(xì)胞增生灶，胸腺、法氏囊髓質(zhì)細(xì)胞流失。預(yù)防組僅在部分器官有少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)，證明以ALV-J TM為靶蛋白，以RNAi的方式抑制病毒復(fù)制是非常有效的抗病毒方式。本實(shí)驗(yàn)的完成不僅為逆轉(zhuǎn)錄病毒的防