結核病有關新進展

1、結核病有關新進展 西南醫(yī)院呼吸科 胡建林,結核病一直是發(fā)展中國家較嚴重的傳染病，1985年以來艾滋病的流行、結核感染者的涌入等原因便美國等歐美發(fā)達國家結核病發(fā)病率呈回升趨勢，尤其是結核病耐藥問題使結核病治療更是雪上加霜。目前全世界有結核病人約2000萬，每,年新增結核病人800～1000萬，每年死亡人數(shù)約300萬;我國的結核病疫情也相當嚴重，2000年第四次全國結核病流行病學調(diào)查結果表明我國有結核病人500萬，每年死亡人數(shù)約2

2、3.8萬，結核病死亡在我國各種死亡原因中居第十一位，在傳染病中,居第一位。1993年世界衛(wèi)生組織(WHO)采用特別步驟宣布結核病全球告急。面對這種嚴峻的形勢，結核病的預防和治療已引起國內(nèi)外學者的高度重視。,簡述： 結核病DNA疫苗 結核病診斷分型 診斷方法進展 抗結核藥物進展 結核病耐藥問題,結核病DNA疫苗,目前用于結核病預防的疫苗是卡介苗(BCG)，它自1921年以來就一直被用于人類結核病的預防，但經(jīng)過半個

3、多世紀的臨床對照試驗研究，BCG對肺結核的免疫保護力是0～80%，差異很大，1995年WHO總結出BCG不是預防肺結核的有效疫苗。,此外，對于免疫功能缺陷的病人，BCG接種有可能導致全身播散。因此，有必要研制新疫苗。,1990年Wolff等在一次基因治療的實驗研究中意外地發(fā)現(xiàn)不加任何處理的基因也可在骨酪肌細胞中表達蛋白至少2個月。1992年Tang等報道人生長激素編碼基因的重組質粒接種小鼠后，可誘發(fā)機體產(chǎn)生抗人生長激素抗體。1993年U

4、lmer等首先,報道用甲型流感病毒基因免疫小鼠，不僅可表達蛋白，刺激機體產(chǎn)生特異性免疫應答，還可保護小鼠抵抗異株流感病毒的攻擊。至此，產(chǎn)生了核酸疫苗(Nucleic Acid Vaccine)或基因疫苗(Genetic Vaccine )、基因免疫(Genetic immunization)、核酸免疫,(Nucleic Acid Immuniztion)的全新概念，開創(chuàng)了免疫學和疫苗學的新領域。,核酸疫苗(Nucleic Acid Im

5、muniztion)包括DNA疫苗和RNA疫苗，由能引起機體保護性免疫反應的病原體抗原的編碼基因和真核表達載體構建而成，它被注入機體后，通過宿主細胞的轉錄系統(tǒng)表達蛋白抗原，誘導宿主產(chǎn)生細胞免疫應答和,體液免疫應答，從而達到預防和治療疾病的目的。由于RNA疫苗不穩(wěn)定，在體內(nèi)存在時間短，表達短暫，生產(chǎn)、貯存、運輸比DNA疫苗要求高, 因此，目前研究最多的是DNA疫苗，其不需要任何化學載體，故又稱為裸DNA疫苗（Naked DNA Vacci

6、ne）,。幾個流感、艾滋病、乙型肝炎、瘧疾、結腸癌、T細胞淋巴瘤等DNA疫苗在美國和歐洲已進入Ⅰ或Ⅱ期臨床試驗。1996年以來WHO將結核病核酸疫苗研究列為資助的項目之一。,一、結核病DNA疫苗的研究現(xiàn)狀,DNA疫苗可誘導全面的免疫反應，尤其是特異性CTL可識別、殺傷、破壞被感染的細胞及清除細胞內(nèi)的病原體，這對于消除寄生于巨噬細胞內(nèi)的結核分支桿菌非常有意義。結核病DNA疫苗的研究正日益深入。,(一)結核病預防性DNA疫苗,迄今大約有以下

7、結核病預防性DNA疫苗在動物實驗中獲得了較理想的效果。,1．Ag85復合物編碼基因； 2．Pst S編碼基因；3．ESAT6編碼基因和MPT64編碼基因； 4．65kDa熱休克蛋白(hsp60)編碼基因； 5．Hsp70編碼基因； 6．36kDa編碼基因； 7．19kDa或ahpC編碼基因; 8.22kDa編碼基因; 9.HsplO編碼基因;,(二)結核病治療性DNA疫苗,目前用于結核病治療的免疫調(diào)節(jié)

8、劑主要有二類:一類是非特異性的如IFN-Y、IL-2、IL-l2等細胞因子;另一類是特異性的母牛分支桿菌菌苗(商品名維卡菌苗)，是由母牛分支桿菌經(jīng)高溫滅活后凍千制成的。由于前者半衰期短，費用高;而后者,是死菌只能誘導體液免疫和Thl型細胞應答;不能誘導特異性CTL應答。DNA疫苗在細胞內(nèi)生成內(nèi)生性抗原，不僅能誘導體液免疫和Thl型細胞應答，還能誘導特異性CTL應答。因此，結核病DNA疫苗不僅有可能成為結核病預防性疫苗，還可能成為治療性疫

9、苗。,1999年Lowrie等首次將hsp6O、hsp7O和ESAT6質粒DNA疫苗用于小鼠結核病模型的治療，以BCG質粒載體和生理鹽水為對照，hsp6O和hsp7ODNA疫苗誘導產(chǎn)生的IFN-7水平顯著高于BCG、質粒載體和生理鹽水對照組，并使免疫小鼠脾、肺菌落計數(shù)顯,著低于其它各組;但ESAT-6DNA疫苗的治療效果不是很明顯。hsp6ODNA疫苗還可使結核病化療后體內(nèi)殘余的菌數(shù)顯著減少。該研究結果證明了某些結核病DNA疫苗作為特異

10、性免疫調(diào)節(jié)劑的可能性。但IL-l2的表達質粒與hsp60DNA疫苗聯(lián)合注射未,能觀察到協(xié)同效應，其肺和脾菌落計數(shù)均比它們單獨免疫的高。,目前關于結核病治療性DNA疫苗的研究報道還不多，由于采用的小鼠模型不同，而且小鼠對結核分支桿菌不敏感，因此，各研究結果也不盡相同。,(三)制備抗血清,DNA疫苗免疫后可激起機體產(chǎn)生體液免疫應答，產(chǎn)生高效價的特異性多克隆抗體，從而為抗血清的制備開辟了一條簡便、快速的新途徑。,(四)DNA疫苗可能的免疫學機

11、理,DNA疫苗的免疫學機理尚不十分清楚。結核病DNA疫苗被導人宿主骨酪肌細胞內(nèi)，并在細胞內(nèi)表達結核菌蛋白抗原，加工后形成多肽抗原，與宿主細胞MHC I類和MHC Ⅱ類分子結合，被呈遞給宿主的免疫識別系統(tǒng)，從而引發(fā)特異性細胞和,體液免疫應答。一般認為激活Thl輔助T細胞和CD8+CTL是機體建立結核病保護性免疫所必需的。,DNA轉入肌肉細胞后引起免疫應答的機理目前有二種假說:(1)外源性DNA在肌細胞中表達，肌細胞分泌或死亡后釋放所表達的

12、蛋白，進入血液循環(huán)后刺激抗體產(chǎn)生。(2)骨髓來源的抗原提呈細胞(APC)攝入肌細胞局部釋放的抗原，而后通過,MHCI類分子提呈給T淋巴細胞，誘導出CTL反應。即使有了活躍的CTL存在，多數(shù)表達抗原肌細胞因其表達的MHCI類分子水平很低，不被CTL溶解破壞，從而長期表達抗原，持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)。這可能是DNA疫苗肌肉注射后能長時間維持免疫的原因。,DNA疫苗具有較長的免疫記憶能力，其機制尚不清楚，可能是因為它在體內(nèi)相當于抗原的儲存庫，不僅刺

13、激免疫記憶，本身就有免疫記憶能力。Kamath等的研究表明DNA疫苗免疫后，可使分泌γ干擾素的T細胞較早出現(xiàn)，并使其反應增強。,(二)DNA疫苗的安全性,DNA疫苗的安全性還存在一定爭議。雖然目前所有動物模型研究均己證明DNA疫苗安全有效，但沒有足夠的依據(jù)能排除理論上可能的危險性，還需進一步建立合適的方法檢測、排除下列危險性的存在。,1．可能整合人宿主細胞基因組。通過甲基化分析，酶切分析和PCR技術等研究表明，進入骨酪肌細胞的DNA分子

14、獨立存在于細胞質中，未發(fā)現(xiàn)復制或整合。,2．可能引起免疫系統(tǒng)功能紊亂：(l)誘導產(chǎn)生抗自身DNA或抗自身組織細胞的抗體，引起自身免疫性疾病。，(2)少量表達的抗原可與誘導產(chǎn)生的抗體形成復合物，引起免疫抑制。(3)誘導機體產(chǎn)生特異免疫耐受。,結核病診斷分型（1999年結核病分類標準）,1．原發(fā)型肺結核:為原發(fā)結核感染所致的臨床病癥，包括原發(fā)綜合征及胸內(nèi)淋巴結結核。,2．血行播散型肺結核:包括急性血行播散型肺結核(急性粟粒型肺結核)及亞急

15、性、慢性血行播散型肺結核。,3．繼發(fā)型肺結核:是肺結核中的一個主要類型，包括浸潤性、纖維空洞及千酪性肺炎等。,4．結核性胸膜炎:臨床上己排除其它原因引起的胸膜炎。包括結核性干性胸膜炎、結核性滲出性胸膜炎、結核性膿胸。,5．其它肺外結核:按部位及臟器命名，如骨關節(jié)結核、結核性腦膜炎、腎結核、腸結核等。,診斷方法進展：噬菌體裂解法快速鑒定結核分支桿菌,分支桿菌噬菌體在1947年首次分離，至今已分離出250余種。近20年來，分支桿菌噬菌體廣

16、泛用于DNA重組技術中，近年來在分支桿菌快速鑒定及藥物敏感性試驗中得以廣泛應用。該方法的基本原理是分支桿菌噬菌體只能感染相應的活的分,支桿菌，如待檢標本中無相應的分支桿菌，則噬菌體被隨后加入的殺毒劑全部殺死，故隨后加入的指示細胞因未受噬菌體感染，因此能在培養(yǎng)皿中生長繁殖，無噬菌斑出現(xiàn);如待檢標本中含有相應的分支桿菌，,則噬菌體侵入菌體內(nèi)，免遭殺毒劑破壞，并在菌體內(nèi)大量增殖，最終裂解菌體，釋放出來的噬菌體即可感染指示細胞，并使指示細胞裂解

17、出現(xiàn)噬菌斑。因此，根據(jù)噬菌斑的有無，即可確定待檢標本中是否含有相應的活的分支桿菌。另外，由,于所用指示細胞生長繁殖速度快，18～24h即可觀察結果，因此本法具有快速診斷價值。,國外報道，200-300cfu/ml MTB即可以該法檢出，國內(nèi)報道1000cfu/mlMTB可被檢出，因此具有較高的靈敏度。特異性試驗結果表明，只有結核分支桿菌復合群才出現(xiàn)陽性結果，而常見NTM和常見呼吸道感染細菌檢測結果均為陰性。,分組 樣本數(shù) 陽性

18、數(shù)(%)涂陽培陽20 19(95)涂陰培陽21 15(71)涂陰培陰19 5(26),總之，本法快速、簡便，又有很高的特異性和較高的敏感性，不失為結核病快速診斷的有效實驗方法之一。,盡管本法將有可能成為結核病快速診斷的有效手段，但下列因素應予注意，以免影響結果。(1)每次實驗必須設各種對照，以保證結果的可靠性;(2)加入殺毒劑后一定要徹底搖勻，以,殺死全部噬菌體;(3)澆注平板的瓊脂溫度不要