犬瘟熱病毒單克隆抗體夾心ELISA方法的建立與膠體金免疫層析試紙條的制備.pdf

1、犬瘟熱(Canine Distemper, CD)是犬等肉食動物中的一種高度接觸性、致死性傳染病，是危害犬養(yǎng)殖業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)及野生動物保護業(yè)最嚴重的疫病之一。
　　 本實驗旨在建立犬瘟熱病毒單克隆抗體夾心ELISA方法、制備膠體金免疫層析試紙條，適用于臨床犬瘟熱病毒的快速檢測。實驗內容包括兩部分:
　　 實驗一:將分泌犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株1D7和3H11，分別腹腔注射BALB/c小鼠，制備單克隆抗體腹水

2、，純化并鑒定。將單克隆抗體3H11加以辣根過氧化物酶標記，以單抗1D7作為包被抗體，以酶標抗體3H11作為檢測抗體，建立檢測犬瘟熱病毒的單克隆抗體夾心ELISA方法。對最佳工作條件進行了優(yōu)化，最終確定:單抗1D7的包被濃度為20μg/mL，包被最佳條件為4℃過夜，最佳封閉液為5％的脫脂奶粉，酶標抗體工作濃度為1∶4000。
　　 包被的犬瘟熱抗體與犬細小病毒(CPV)、犬冠狀病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒Ⅰ型

3、(CAV-Ⅰ)等無交叉反應;建立雙抗夾心ELISA方法可以檢測到的最低病毒含量為102 TCID50/mL;板內和板間變異系數(shù)在0.5％～6.3％之間;對50份臨床樣品檢測并與商品試劑盒比較，兩者共同符合率為92％。以上試驗結果表明建立的犬瘟熱病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法具有特異性強、敏感度高、重復性好等優(yōu)點。
　　 實驗二:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，標記純化的單抗3H11，制備金標抗體玻璃纖維素膜;將純化的單抗1D7

4、作為捕獲抗體，固定于硝酸纖維素膜(NC)上，制備膠體金免疫層析檢測試紙條。對最佳工作條件進行了優(yōu)化，最終確定:膠體金標記抗體3H11的最佳濃度為17μg/mL，標記最佳pH值為8.0;包被于NC膜的抗體1D7濃度為2.0 mg/mL。
　　 制備的膠體金免疫層析檢測試紙條不與犬細小病毒(CPV)、犬冠狀病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒(CAV-1)等發(fā)生交叉反應;敏感性試驗結果表明，試紙條可以檢測到的最低病毒含