犬瘟熱病毒H基因原核表達(dá)及間接ELISA的建立.pdf

1、犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）是犬瘟熱（canine distemper，CD）的病原體。CD是威脅犬類健康的最嚴(yán)重傳染病之一，發(fā)病后死亡率極高，且無(wú)特異性治療藥物。為此，本試驗(yàn)針對(duì)CDV的N基因，建立了快速診斷RT-PCR方法；同時(shí)通過RT-PCR方法擴(kuò)增CDV部分H基因，通過原核表達(dá)、復(fù)性，成功表達(dá)出CDV H蛋白，并構(gòu)建了H蛋白間接ELISA方法，證實(shí)表達(dá)的H蛋白具有免疫原性，具體內(nèi)容如下：

2、r>　　1．根據(jù)GenBank公布的CDV N蛋白基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，成功擴(kuò)增出464bp的CDV N基因片段。測(cè)序結(jié)果表明該序列與GenBank已經(jīng)發(fā)表CDV基因序列的同源性為94.8％～98.5%。利用本文建立的CDV檢測(cè)RT-PCR方法對(duì)30例疑似CDV病例檢測(cè)顯示：RT-PCR檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率為90%、膠體金試紙陽(yáng)性檢出率為86.7%，說明RT-PCR方法檢出率和敏感性更優(yōu)。
　　2．血凝素蛋白是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)

3、生中和抗體的主要蛋白之一。本文去除H基因高度疏水區(qū)核苷酸設(shè)計(jì)引物，成功克隆了來自南昌CDV病料中CDV長(zhǎng)度為1236nt的H基因片段。將該基因片段插入到載體pET32a中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-CDVH，重組蛋白H基因在Rosetta菌中獲得了高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在，經(jīng)包涵體洗滌、復(fù)性、Ni柱純化、透析濃縮，最終獲得濃度為0.561mg/mL重組H蛋白溶液。小鼠免疫試驗(yàn)顯示，重組蛋白免疫產(chǎn)生的血清抗體效價(jià)在1:1