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文檔簡(jiǎn)介
1、鴨圓環(huán)病毒(duck circovirus,DuCV)是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員之一,主要引起宿主的淋巴系統(tǒng)損傷,導(dǎo)致免疫抑制,進(jìn)而引起繼發(fā)感染或二重及多重感染,已引起越來(lái)越多的關(guān)注。美國(guó)、匈牙利、德國(guó)和中國(guó)臺(tái)灣等地區(qū)相繼報(bào)道在番鴨、半番鴨、櫻桃谷肉鴨中發(fā)現(xiàn)該病毒。國(guó)內(nèi)福建、山東、浙江和廣州等省份的流行病學(xué)調(diào)查,也證實(shí)了DuCV的普遍存在。
DuCVcap蛋白是DuCV的主要的免疫原性蛋白,也是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白。為了能
2、夠得到DuCV的免疫原性蛋白,并以此建立診斷方法,為鴨場(chǎng)大規(guī)模樣品中檢測(cè)DuCV抗體提供依據(jù)。研究用DuCVcap基因原核表達(dá)蛋白,并進(jìn)行純化,建立間接ELISA方法,初步應(yīng)用于安徽省部分鴨場(chǎng)DuCV抗體檢測(cè)。具體如下:
首先利用軟件對(duì)DuCVAQ0901株cap基因的保守區(qū)域進(jìn)行分析,設(shè)計(jì)了一條特異性引物,將N末端影響外源蛋白表達(dá)的稀有密碼子截去后,將其克隆到原核表達(dá)載體PET-28a中,并在完成對(duì)構(gòu)建質(zhì)粒PCR、Eco
3、R/ⅠSalⅠ雙酶切鑒定,測(cè)序鑒定后,用誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),同時(shí)對(duì)誘導(dǎo)劑濃度,誘導(dǎo)時(shí)間,蛋白表達(dá)的可溶性等條件進(jìn)行優(yōu)化。在大量表達(dá)重組dcap蛋白后,利用NI純化樹脂對(duì)His-dcap蛋白進(jìn)行純化,同時(shí)還對(duì)重組蛋白的濃度,純度以及免疫活性等特性進(jìn)行檢測(cè),并用純化好蛋白免疫健康櫻桃谷肉鴨,制備了多克隆抗體血清。結(jié)果顯示,構(gòu)建好的pET-28a-dcap重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)后,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)及Western-blot分析證明
4、,在大腸桿菌中得到了高效表達(dá),并以包涵體的形式表達(dá);用NI純化樹脂對(duì)His-dcap蛋白進(jìn)行純化后,蛋白濃度可達(dá)1.285mg/mL,且表達(dá)蛋白保留了部分天然cap蛋白的抗原性;利用純化蛋白乳化后制備多克隆抗體血清經(jīng)瓊擴(kuò)試驗(yàn)測(cè)定抗體效價(jià)可達(dá)1∶128。
其次利用上述純化好dcap蛋白建立一種檢測(cè)cap抗體的間接ELISA方法,為規(guī)模化鴨場(chǎng)DuCV感染情況調(diào)查提供快速簡(jiǎn)易的血清學(xué)方法。即利用純化好的蛋白(dcap)作為包被抗
5、原,制備cap抗體陰陽(yáng)性血清,用矩陣法篩選最佳工作濃度,同時(shí)也對(duì)抗原包被時(shí)間、一抗孵育時(shí)間、二抗反應(yīng)時(shí)間、底物顯色時(shí)間等條件優(yōu)化確定,計(jì)算出陰陽(yáng)性血清臨界值及結(jié)果判定方法。并用此方法對(duì)安徽省部分鴨場(chǎng)采集血清進(jìn)行了DuCV抗體檢測(cè)。用純化cap蛋白包被酶標(biāo)板,建立特異性檢測(cè)cap抗體的間接ELISA方法。確定該方法蛋白最佳包被量為6.57 μg/mL,血清最佳稀釋度為l∶80,陰陽(yáng)性臨界值為0.391??乖罴寻粫r(shí)間為4℃過(guò)夜,一抗孵育
6、、二抗反應(yīng)、底物顯色最佳時(shí)間分別為1h,1h,15min。并用建立的間接ELISA方法,對(duì)安徽部分地區(qū)收集的338份鴨血清樣品進(jìn)行cap抗體檢測(cè),結(jié)果檢出陽(yáng)性率為26.9%,證明了安徽部分地區(qū)鴨場(chǎng)中DuCV的感染普遍存在。用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,顯示安徽省部分地區(qū)鴨群中以櫻桃谷肉鴨的DuCV感染率較高;不同日齡段的鴨群中DuCV的感染情況,以30-60日齡段高于其它日齡段;不同地區(qū)間DuCV陽(yáng)性檢出率也存在著一定程度的差異。
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