犬瘟熱病毒H蛋白基因片段的克隆與原核表達(dá).pdf

1、犬瘟熱病是由犬瘟熱病毒(CDV)感染犬和其他食肉動物的多發(fā)性、致死性傳染病。CDV屬于副粘病毒科麻疹病毒屬，為有囊膜的負(fù)鏈線性RNA病毒，基因組長約16kb?；蚪M中包括6個非重疊基因區(qū)。它們的編碼基因按3′-5′端順序依次為N-P-M-F-H-L系列。最新研究表明CDV融合蛋白(F)和血凝素(H)蛋白是宿主免疫系統(tǒng)的主要目的抗原，是產(chǎn)生中和抗體的重要抗原之一。核衣殼(N)蛋白是保守性較強(qiáng)的免疫原性蛋白，此外N蛋白上含有T細(xì)胞表位。H，

2、F和N蛋白在犬瘟熱的免疫預(yù)防方面起重要作用。 根據(jù)發(fā)表的犬瘟熱病毒vaccine strain毒株序列設(shè)計(jì)一對引物，以犬瘟熱病毒vaccine strain株感染Vero細(xì)胞收獲病毒提取的RNA為模板，做RT-PCR擴(kuò)增出H基因的3′端大小為549bp的基因片段。擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，篩選氨芐青霉素抗性菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定、PCR分析，將檢測陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果顯示獲得的CDV

3、疫苗株的序列，與Genbank中疫苗株株H基因同源性為100％。將重組質(zhì)粒pMD18-H和表達(dá)載體pGEX-4T-1同時用EcoRⅠ和SalⅠ酶切后，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-H，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌Rosetta<'TM>，中，在37℃1.0mM IPTG誘導(dǎo)下，H基因片段獲得了表達(dá)，收集不同時間的菌液進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot分析檢測，結(jié)果表明犬瘟熱病毒H基因片斷在大腸桿菌中能高效表達(dá)，并能被犬瘟熱病毒陽性血