水貂犬瘟熱病毒F基因的克隆及序列分析和表達.pdf

1、犬瘟熱(Canine Distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)感染引起的一種急性、高度接觸性傳染性疾病，是當前我國對養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)危害最大的疫病之一。常規(guī)弱毒疫苗雖然在CD防控中發(fā)揮了非常重要的作用，但是也存在諸多缺點。為了研究新一代安全、高效的CD基因工程疫苗，本研究對本研究室分離的犬瘟熱病毒分離株(CDVSJ)融合蛋白(F)基因進行了克隆、序列分析，構(gòu)建了F基因的真核表達載體，并在BHK-21細胞中表達。本試驗將為

2、構(gòu)建有效的預防CD的基因工程疫苗打下基礎(chǔ)。 1、根據(jù)GenBank上發(fā)表的CDV Onderstepoort弱毒株F序列設(shè)計一對引物，對犬瘟熱病毒水貂分離株CDVSJ株的F蛋白基因進行了RT-PCR擴增，并將其插入到pMD 18-T中，構(gòu)建克隆載體pMD-18T-F。經(jīng)序列測定，克隆的CDVSJ株F基因長1053bp，編碼351個氨基酸。比較GenBank中收錄的其它CDV毒株序列，發(fā)現(xiàn)CDVSJ株F基因與00-2601 USA

3、株、01-2689 USA株、MS01 China株、ONP株、A75-17株、PDV-2株、DOGDK91C株核苷酸序列同源性分別為95.4％、94.4％、93.3％、97.3％、94.5％、94.7％、93.9％；CDVSJ株F基因與00-2601 USA株、01-2689 USA株、MS01 China株、ONP株、A75-17株、PDV-2株、DOGDK91C株氨基酸序列同源性分別為95.4％、94.4％、93.3％、97.3％

4、、94.5％、94.7％、93.9％。但是在對CDVSJ與ONDER疫苗株、00-2601 USA株、MS01 China株、PDV-2株的抗原指數(shù)的分析中發(fā)現(xiàn)分離株CDVSJ與疫苗ONP株、00-2601 USA株、MS01 China株、PDV-2株在40-60位氨基酸間抗原指數(shù)存在較大差異；在110-120位氨基酸之間ONDER株和00-2601株抗原指數(shù)相同，其余三者在此區(qū)間抗原指數(shù)基本一致但是低于ONDER株和00-2601株

5、抗原指數(shù)；在120-135位氨基酸之間只有PDV-2株的抗原指數(shù)與其余四者有相當大的差異性；在135-140位、190-200位和340-351位氨基酸分離株CDVSJ的抗原指數(shù)都與其余四者有著差異性。這表明有可能是由于不同分離株與疫苗ONP株之間預測的潛在的蛋白質(zhì)抗原決定簇諸多差異性從而導致了免疫的失敗。 2、對克隆載體pMD18T-F進行雙酶切、回收純化后，將得到的CDVSJ F基因定向克隆到pcDNA3.1真核表達載體中，

6、經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，通過間接熒光抗體檢測法和RT-PCR法檢測了重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1-F在BHK-21細胞中的瞬時表達情況。結(jié)果表明，提取pCDNA3.1-CDVF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞總RNA，進行RT-PCR反應，獲得1053bp的特異性F基因條帶；間接熒光抗體檢測重組質(zhì)粒pcDNA3.1-F轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞呈現(xiàn)特異性的黃綠色的熒光，而空載體pCDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞與正常BHK-21細