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文檔簡介
1、犬瘟熱(Canine Distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)感染引起的一種急性、高度接觸性傳染性疾病,是當前我國對養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)危害最大的疫病之一。常規(guī)弱毒疫苗雖然在CD防控中發(fā)揮了非常重要的作用,但是也存在諸多缺點。為了研究新一代安全、高效的CD基因工程疫苗,本研究對本研究室分離的犬瘟熱病毒分離株(CDVSJ)融合蛋白(F)基因進行了克隆、序列分析,構(gòu)建了F基因的真核表達載體,并在BHK-21細胞中表達。本試驗將為
2、構(gòu)建有效的預防CD的基因工程疫苗打下基礎(chǔ)。 1、根據(jù)GenBank上發(fā)表的CDV Onderstepoort弱毒株F序列設(shè)計一對引物,對犬瘟熱病毒水貂分離株CDVSJ株的F蛋白基因進行了RT-PCR擴增,并將其插入到pMD 18-T中,構(gòu)建克隆載體pMD-18T-F。經(jīng)序列測定,克隆的CDVSJ株F基因長1053bp,編碼351個氨基酸。比較GenBank中收錄的其它CDV毒株序列,發(fā)現(xiàn)CDVSJ株F基因與00-2601 USA
3、株、01-2689 USA株、MS01 China株、ONP株、A75-17株、PDV-2株、DOGDK91C株核苷酸序列同源性分別為95.4%、94.4%、93.3%、97.3%、94.5%、94.7%、93.9%;CDVSJ株F基因與00-2601 USA株、01-2689 USA株、MS01 China株、ONP株、A75-17株、PDV-2株、DOGDK91C株氨基酸序列同源性分別為95.4%、94.4%、93.3%、97.3%
4、、94.5%、94.7%、93.9%。但是在對CDVSJ與ONDER疫苗株、00-2601 USA株、MS01 China株、PDV-2株的抗原指數(shù)的分析中發(fā)現(xiàn)分離株CDVSJ與疫苗ONP株、00-2601 USA株、MS01 China株、PDV-2株在40-60位氨基酸間抗原指數(shù)存在較大差異;在110-120位氨基酸之間ONDER株和00-2601株抗原指數(shù)相同,其余三者在此區(qū)間抗原指數(shù)基本一致但是低于ONDER株和00-2601株
5、抗原指數(shù);在120-135位氨基酸之間只有PDV-2株的抗原指數(shù)與其余四者有相當大的差異性;在135-140位、190-200位和340-351位氨基酸分離株CDVSJ的抗原指數(shù)都與其余四者有著差異性。這表明有可能是由于不同分離株與疫苗ONP株之間預測的潛在的蛋白質(zhì)抗原決定簇諸多差異性從而導致了免疫的失敗。 2、對克隆載體pMD18T-F進行雙酶切、回收純化后,將得到的CDVSJ F基因定向克隆到pcDNA3.1真核表達載體中,
6、經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BHK-21細胞,通過間接熒光抗體檢測法和RT-PCR法檢測了重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1-F在BHK-21細胞中的瞬時表達情況。結(jié)果表明,提取pCDNA3.1-CDVF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞總RNA,進行RT-PCR反應,獲得1053bp的特異性F基因條帶;間接熒光抗體檢測重組質(zhì)粒pcDNA3.1-F轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞呈現(xiàn)特異性的黃綠色的熒光,而空載體pCDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞與正常BHK-21細
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